J774A.1，中文名小鼠单核巨噬细胞，在贴壁细胞中属于难消化的细胞类型，是新手小伙伴最头痛的细胞之一。其最大的难点就是难消化，一般细胞用胰酶消化1-2分钟就消化下来了，再长的半个小时都行了，可这细胞消化到1ml 0.25%胰酶消化液用没了还没消化下来。

今天小编请教了几位技术老师为大家带来J774A.1的细胞消化教学步骤。

一、使用细胞刮刀刮下来

1.准备材料

消毒过的未拆封细胞刮刀一支、超净台、消毒过的未拆封离心管、消毒过的未拆封移液管(5-10ML)、消毒过的移液枪

2.操作步骤

1）超净台提前打开消毒30分钟，操作人员全身消毒进行无菌规范步骤；

2）从培养箱中取出装有J774A.1的T25培养瓶和消毒过的未拆封细胞刮刀一起放置在超净台上，其他物品保持未拆封放置在超净台顺手位置（注意：培养瓶竖起放置且瓶盖不要提前旋开，防止污染。）；

3）拆开细胞刮刀后，将刮刀单手举起（勿碰到桌面）；另一只手单手旋开培养瓶盖，瓶盖内面朝上放置；

4）将细胞刮刀伸入瓶内，通过瓶内无细胞面调整刮刀刀头方向，由外朝内刮动。

5)使用完成后，直接丢弃细胞刮刀（无须将细胞刮刀放入瓶内培养基内搅动，防止细胞受到刺激），使用移液枪吸取瓶内培养基轻柔地吹下瓶壁，将细胞与培养基混合，反复2-3次；

6)使用移液枪将细胞与培养基的混合溶液移入离心管，之后使用离心机进行离心，之后步骤可参照正常传代或冻存步骤操作。

二、使用胰酶长时间消化

一般该步骤是技术部不建议使用的，一是长时间消化会对细胞造成伤害，二是J774A.1属于巨噬细胞，胰酶对其的刺激会导致其分化变得越来越难消化。

若实验室设备暂无细胞刮刀且该细胞急于传代可使用此方法进行应急操作。

1.准备材料

细胞培养箱、含10%FBS的完全培养基、0.25%胰酶消化液(新)、超净台、消毒过的未拆封离心管、消毒过的未拆封移液管(5-10ML)、消毒过的移液枪、消毒过的未拆封滴管(5ML)

2.操作步骤

1)超净台提前打开消毒30分钟，将0.25%胰酶消化液放置至常温，操作人员全身消毒进行无菌规范步骤；

2)从培养箱中取出装有J774A.1的T25培养瓶和胰酶消化液一起放置在超净台上，其他物品保持未拆封放置在超净台顺手位置（注意：培养瓶竖起放置且瓶盖都不要提前旋开，防止污染。）；

3)拆开移液管装在移液枪上并单手举起（勿碰到桌面），另一只手单手旋开培养瓶盖，瓶盖内面朝上放置，将瓶内培养基吸走倒入废液桶，并丢弃移液管，将移液枪放回原处；

4）拆开5ML滴管并单手旋开消胰酶消化液瓶盖，瓶盖内面朝上放置，吸取1ML胰酶消化液后盖上胰酶消化液瓶盖，将胰酶消化液放入装有J774A.1的T25培养瓶内盖上瓶盖并丢弃滴管，将胰酶消化液放回原处；

5）将装有J774A.1的T25培养瓶放入37℃，5%CO2，95%AIR的培养箱静置30min，之后取出后弃掉使用的胰酶后再次重复上一步操作；

6)以此步骤消化满1h后，使用移液枪将培养瓶内的胰酶移入废液桶，换一根新的移液管后移入5ML含10%FBS的完全培养基终止消化，使用移液枪吸取瓶内培养基轻柔地吹下瓶壁，将细胞与培养基混合，反复2-3次。使用移液枪将细胞与培养基的混合溶液移入离心管，之后使用离心机进行离心，之后步骤可参照正常传代或冻存步骤操作。