大家好，今天我们来了解一篇水凝胶文章——《Dual-Temperature/pH-Sensitive Hydrogels with Excellent Strength and Toughness Crosslinked Using Three Crosslinking Methods》发表于《Gels》。水凝胶在生物医药领域应用广泛，它能存储药物、控制药物释放，还具有良好的生物相容性。但以往水凝胶的机械性能较差，限制了其应用。为解决这一问题，有研究制备了三种不同交联方式的水凝胶，并对其进行了多项测试。这些水凝胶具有温度和pH双重响应性，且在热稳定性、机械性能等方面表现出色，在生物医药领域具有广阔的应用前景。接下来，我们详细了解一下。
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一、引言
水凝胶因其具有存储药物、控制药物释放速度、良好的生物相容性和灵活性等功能，在生物医学领域有着广泛的应用。智能响应水凝胶能对环境刺激做出响应，其中温度和pH是人体的重要生理参数。在人体组织病变中，这两个值往往会发生变化，因此选择具有适当温度和pH刺激响应的水凝胶作为靶向治疗的载体非常必要。此外，水凝胶的机械性能是其作为生物医学材料的重要指标，但在水或复杂生理条件下，水凝胶往往会因吸水膨胀而导致机械性能大幅降低，这极大地限制了其在生物医学领域的实际应用。为了解决这些问题，本研究制备了三种基于不同交联方法的水凝胶，并对其性能进行了详细的研究。
二、实验内容
2.1 合成步骤
首先，通过DBU催化羟乙基甲基丙烯酸酯（HEMA）和丙交酯的开环聚合，合成了 HEMA-PLLAₙ和HEMA-PDLAn，然后将其超声形成立体复合物HEMA-(PLLA-PDLA)ₙ，该复合物通过分子间氢键交联在一起。
接着，将立体复合物分别进行叠氮化和炔基化，合成了HEMA-(PLLA-PDLA)-N₃和 HEMA-(PLLA-PDLA)-alkyne，然后通过点击反应生成三唑。
最后，通过一锅法自由基共聚合成了三种水凝胶。具体来说，对于物理交联水凝胶（gel1），使用HEMA-(PLLA-PDLA)ₙ、温度敏感单体MEO₂MA和OEGMA以及pH敏感单体DEAEMA进行合成；对于物理-化学双交联水凝胶（gel2），在gel1的基础上加入化学交联剂EGDMA；对于物理-化学点击三重交联水凝胶（gel3），使用三唑聚合物、温度敏感单体MEO₂MA和 OEGMA、pH敏感单体DEAEMA以及化学交联剂EGDMA进行合成。
2.2 结构表征
2.2.1 对大分子单体的表征：
1H NMR：以聚合度为30的大分子单体为例，在1H NMR谱图中，6.10 ppm（a）和5.58 ppm（b）为双键的质子峰，5.27-5.08 ppm（c）与 1.63-1.53 ppm（f）为PLA重复单元的次甲基和甲基质子峰，4.41-4.28 ppm（d）为 O=COCH₂CH₂O-部分的亚甲基质子峰，1.92 ppm（e）为- (CH₃)C=CH₂基团的甲基质子峰，证明了HEMA-PLLA30的成功合成。HEMA-PLLA30和HEMA-PDL A30的1H NMR图谱一致。
FT-IR：在FT-IR谱图中，1753 cm⁻¹和3511 cm⁻¹（3488 cm⁻¹）分别为C=O和-OH的伸缩振动峰，1196 cm⁻¹为C-O-C的伸缩振动峰，1633 cm⁻¹为C=C的伸缩振动峰，3000 cm⁻¹ 为甲基和亚甲基的弯曲振动和伸缩振动峰，证明了大分子单体HEMA-PLLA30和HEMA- (PLLA-PDLA)的成功合成。
XRD：通过XRD研究发现，HEMA-PLLA的衍射峰出现在2θ=17°，而HEMA-(PLLA-PDLA) 的衍射峰出现在2θ=12°、21°和24°，大分子单体的同质峰消失，证明了PLLA和PDLA通过立体络合形成了立体复合物HEMA-(PLLA-PDLA)。
2.2.2 对水凝胶的表征：
FT-IR：在FT-IR谱图中，三种水凝胶在2988 cm⁻¹和1458 cm⁻¹处均出现了-CH₃-的弯曲振动峰和伸缩振动峰，在1729 cm⁻¹处出现了-C=O-的伸缩振动峰，在1194 cm⁻¹处出现了-C-O-C-的伸缩振动峰，在1128 cm⁻¹处出现了-N⁺(CH₂)₃的振动吸收峰，证明了水凝胶的成功合成。
XRD：三种水凝胶的XRD曲线在2θ=12°处均出现了衍射峰，证明了三种水凝胶中均存在立体复合交联。
2.3 形态分析
使用台式扫描电子显微镜观察水凝胶的表面形态。三种交联水凝胶都有许多孔隙，孔隙大小依次为gel1 > gel2 > gel3。这是因为随着交联模式的增加，交联密度增大，作用点增多，孔隙逐渐变小。
2.4 温度敏感性测试
在25°C和pH=7的二次去离子水中进行动态溶胀实验，观察水凝胶的溶胀情况，然后将溶胀平衡的水凝胶转移到40°C和pH=7的二次去离子水中，观察其退胀动力学。
不同交联模式的水凝胶在25°C时均有明显的溶胀，这是因为凝胶中的亲水部分P (MEO₂MA-co-OEGMA)与水分子在25°C时形成氢键，导致凝胶吸水膨胀。溶胀率依次为gel1 > gel2 > gel3，其中物理交联水凝胶的溶胀率最高，超过60，物理-化学双交联水凝胶的溶胀率约为5，三重交联水凝胶的溶胀率仅约为3。
在40°C时，水凝胶的退胀率依次为gel1 < gel2 < gel3，这是因为随着交联点的增加和交联密度的增大，凝胶的结构更加稳定，受外部环境的影响更小，表现为退胀率更大。
2.5 pH敏感性测试
在25°C和pH=5的二次去离子水中进行溶胀动力学实验，观察水凝胶的溶胀情况，然后将完全溶胀的水凝胶转移到25°C和pH=9的二次去离子水中，观察其退胀动力学。
水凝胶在pH=5时均有溶胀，溶胀率依次为gel1 > gel2 > gel3，其中gel1的溶胀率在8 h时达到63.14，gel2为3.71，gel3为1.20，说明gel1的体积增加显著，gel2次之，gel3最小。这是因为在pH=5时，pH值低于添加的pH敏感单体DEAEMA 的pKa值，凝胶内部结构呈现拉伸状态，孔隙增大，溶胀率开始增加，当pH敏感单体质子化结束时，溶胀率不再增加，曲线趋于平缓。
在pH=9时，所有三种凝胶都有收缩趋势，这是因为环境pH高于DEAEMA的pKa值，发生去质子化，凝胶内部的静电效应消失，结构变得紧凑，孔隙变小，凝胶开始收缩失水，表现出退胀状态。
2.6 可逆性测试
将三种水凝胶放入23°C和40°C的水浴中，固定时间切换，并测量每次的溶胀率。水凝胶的溶胀率在温度恒定变化时基本固定，证明其可逆性良好。
2.7 两亲性测试
将水凝胶放入25°C的二次去离子水和THF中，测量其随时间的溶胀率，并拍摄水凝胶在干态、完全在水中溶胀平衡和在THF中完全溶胀平衡的照片。
水凝胶在水和THF中均有溶胀，且溶胀率先快速增加后趋于平缓，证明其具有良好的两亲性。
所有水凝胶在干态、水中和THF中均发生了溶胀，进一步证明了所有合成的水凝胶都具有两亲性。
2.8 热稳定性测试
通过热重测试测定水凝胶的热稳定性。在TG图中，gel1和gel2分别在约200°C和340°C以及200°C和360°C有两次重量损失，而三重交联水凝胶仅在约350°C有一次重量损失，且第一次失重温度低于三重交联水凝胶，证明三重交联水凝胶具有良好的热稳定性。这是因为随着交联密度的增加，构成凝胶三维网络结构的作用点增多，相对热稳定性逐渐提高。
2.9 机械性能测试
通过动态力学分析测量水凝胶的储能模量，以响应水凝胶的物理机械性能。三种水凝胶的储能模量曲线随振荡频率的增加变化不显著，在9Hz时，储能模量依次为gel1 < gel2 < gel3，分别为9.96 kPa、19.77 kPa和33.81 kPa。gel1、gel2和gel3的储能模量逐渐增加，说明gel3的机械强度最好。此外，在9Hz时，gel1、gel2和gel3的损耗角正切值分别为0.1000、0.0198和0.0338，损耗角正切值非常小，表明凝胶在外部作用力作用下主要表现为弹性，具有更好的韧性。
2.10 持续药物释放测试
通过模拟人体组织环境，使用PBS缓冲液改变pH和温度，研究PBS缓冲液对药物从水凝胶中缓慢释放的影响。
在不同条件下，药物释放率最高的是gel1（c），为14.65%，药物释放率依次为gel1 > gel2 > gel3。在生理参数条件（b）下，gel1、gel2和gel3在168 h后的累积药物释放率分别为4.15%、3.70%和2.65%，均低于5%，说明载药凝胶在正常组织中的药物泄漏较少，降低了对正常组织的毒性。当环境变为微酸性（a）时，gel1、gel2和gel3在168 h后的累积药物释放率分别为 7.45%、3.4%和3.35%，与（b）相比也有所下降；当环境变为高温（c）时，gel1、gel2和gel3在168 h后的累积药物释放率分别为14.65%、5.18%和3.71%，与（b）相比有所增加。
通过研究发现，温度和pH这两个参数对水凝胶中的药物缓慢释放都有影响，其中pH变化对药物释放的影响比温度变化更大。在微酸性环境中，药物能够更快地作用于癌细胞，靶向性更强。此外，三重交联水凝胶在改善机械性能和降低溶胀能力的情况下，对疏水性药物的控制释放影响不大，与双交联水凝胶相比，168 h后药物累积释放量减少不到1%。
三、结论
本研究成功合成了三种水凝胶，即物理交联水凝胶、物理-化学双交联水凝胶和物理-化学点击三重交联水凝胶。这些水凝胶具有良好的温度敏感性、pH 敏感性、可逆性和两亲性。随着交联模式的增加，水凝胶的热稳定性和机械强度增加，实现了三重交联水凝胶达到高熔点和更好机械性能的目的。同时，三重交联水凝胶具有良好的生物相容性、高热稳定性和良好的机械性能，在控制疏水性药物释放方面具有广泛的应用前景。
参考文献：
Wang J, et al. Dual-Temperature/pH-Sensitive Hydrogels with Excellent Strength and Toughness Crosslinked Using Three Crosslinking Methods. Gels. 2024 Jul 19;10(7):480.
