前言/
在讨论细胞存储时，无论是普通人还是科学家，通常将其比喻为保留着“生命的种子”，这种做法被视为对未来的一种预防措施。
但是，这种“希望”是否有其保质期呢？经过5年、10年，甚至是百年的时间，我们存储的这些细胞是否仍然有效？
答案是肯定的。通过将细胞置于-196℃的液氮中，它们的保质期从理论上来看可以长达数百年。
那么，液氮究竟是如何实现这一点的呢？细胞内部发生了哪些神奇的变化？本文将深入探讨这些问题。
尽管人类终将面对死亡的现实，但对于永生的渴望却从古至今未曾减弱。
1967年，美国心理学家詹姆斯·贝德福在癌症晚期时，勇敢地尝试了“穿越时空”的实验。他选择将自己的身体冻藏在深低温仓中，希望在50年后，成熟的永生科技能够将他唤醒，延续他的生命。
△世界首例人体冷冻手术
如今，詹姆斯的计划已经延迟了5年，而他能否成功苏醒，似乎需要更多的时间来得出答案。然而，冻存生命并非空想，至少在细胞水平上，科学家们已经取得了实质性进展。
据报道，已经有精子冻存长达50年之久[1]。这并不意味着细胞保存的上限就是50年，实际上，根据这些精子在2019年依然保持活力的情况看，将它们再保存几十年似乎也并非难事。
△悉尼大学动物繁殖专家Simon de Graaf团队复苏冻存50年精子
要解释这一点，首先需要提及塑造深低温环境的关键物质——液氮
-196℃液氮
为生命按下暂停键
在19世纪，科学界陷入了一场狂热的低温竞赛。
无数科学家努力挑战一个看似不可能完成的任务——达到“绝对零度”（-273℃）。
法国科学家路易斯·保罗·卡耶泰（Louis Paul Cailletet）也参与其中，经过多年的探索，他终于成功将温度降至-196℃，创造出了液态氮。然而，当时科学界对于冻存的概念尚不明确，直到20世纪前后，科学家们才意识到在低温下保存生物成分的好处。随着冻存技术的不断进步，超低温下的液态氮也被引入到了存储中。这两者的结合效果十分显著。
首先，当温度降至-120℃时，细胞内不再发生热依赖性的代谢过程。当温度降至-196℃时，细胞变得微小，分子运动几乎停止。就像按下了“暂停键”一样，生命活动被冻结。
△保罗利用焦耳-汤姆森效应制得了液氮（-196℃）与液氧（-183℃）
因此，在-196℃的环境中，排除其他外部因素的影响，细胞可以永久地保存下来。
氮气是一种优秀的冷却剂，无色无味，化学性质稳定，对被冻存物体几乎无影响。
△在-196℃液氮环境中，连微生物也无法生存
制备液氮更为方便安全，其广泛应用于实验和冻存。-196℃的低温已经足够大多数实验使用。
综上所述，液氮是优异的冷却剂，细胞在其环境下可能实现永久存活。
对于市面上的“液氮疗法”，其使用液氮消灭肿瘤并不意味着液氮不能用于细胞冻存。细胞冻存中使用冷冻保护剂，而不仅仅是液氮。
细胞在低温下的存活，犹如一场考验。尽管-196℃的低温可以实现长期冻存，但细胞要跨越200度的温差却并非易事。
若冻存速度过快，比如直接将细胞置于-196℃的液氮中，温度的剧烈变化足以在短短几秒钟内致命。这是因为在陷入低温环境时，细胞内外的水分会迅速凝固成冰，冰晶会刺穿细胞膜，造成不可逆转的“冰晶损伤”——这也是“液氮疗法”的核心原理。
细胞冻存速度过慢会导致细胞外水结冰，使未结冰的溶液中电解质浓度升高，进而引发细胞脱水或电解质失衡，造成所谓的“溶液损伤”。
为了确保适当，研究人员在液氮冷冻存储时通常使用“冷冻保护剂”和“梯度降温法”。
梯度降温
保障细胞存储不受损害
冷冻保护剂如二甲基亚砜（DMSO），能够稳定细胞蛋白并置换细胞内液，平衡细胞内外的电解质浓度，并降低冰点，减少细胞内部冰晶的形成。这种保护剂似乎可以应对冻存过程中的各种损伤。
然而，仅仅加入保护剂并不能解决所有问题，对冻存温度的控制依然至关重要。
△迅速降温的细胞内产生冰晶，损坏细胞膜及细胞器
实验室通常采用梯度降温法，逐步将细胞降温至4℃、-20℃、-80℃，最后至-196℃（液氮），有时还会在-80℃维持1-2天，让细胞有足够的时间适应温度变化，减少冻存过程对细胞的损伤。
为了规避人为操作可能带来的误差，实验中常常配置精准降温的程序降温仪，以确保细胞环境以稳定的速率（通常为1℃/min或其他根据细胞种类而定的速率）变化，从而为细胞提供一定的保护作用。
因此，在冷冻保护剂和梯度降温的配合下，细胞能够长期存活。而当细胞经过冻存后重新复苏时，它们的活性又会如何呢？
以下是一些长时间细胞冻存的案例。
2020年，一枚27年前冷冻的胚胎被成功“唤醒”，植入蒂娜·吉布森的子宫，当年12月顺利出生，打破当前冷冻时间最长记录（原为24年）。
△只有一个多月大莫莉·吉布森
2018年，《Journal of Immunotherapy》上的文章比较了短期和长期冻存下NK细胞的功能差异。结果显示，冻存时间长短并不影响NK细胞的扩增和抗肿瘤功能，它们在对抗乳腺癌细胞上表现一致。
△长期冻存的NK细胞依然显示出有效的抗肿瘤功能
2014年，湖南女孩晓颖接受了一份“沉睡”15年的脐带造血干细胞的移植，移植前的复苏活性检测高达94.2%。
2012年，《Cryobiology》刊登一则题为“Effectiveness of human mesenchymal stem cells derived from bone marrow cryopreserved for 23-25 years”的文章。其中提到，低温保存长达25年的骨髓干细胞仍能作为实验中MSC的来源，体外展现出良好的功能性和分化能力。
△进行适当的解冻和培养后，可以获得具备生物学特性的间充质干细胞
以上案例表明，保护到位、复苏得当，即使经历漫长冻存，细胞仍能保持活性。
-196℃的深低温存储、冷冻保护剂的应用、精确逐级降温以及其他努力，让细胞在冻存数年乃至上百年后仍能保持活性，实现细胞“跨越时空”，为人们带来新的生命希望。
参考资料：
[1] https://www.myscience.org/news/wire/world_s_oldest_semen_still_viable-2019-Sydney
[2]https://dx.doi.org/10.1111%2Fvsu.12730
[3]https://edition.cnn.com/2020/12/01/us/baby-frozen-embryo-27-years-trnd/index.html
[4]https://doi.org/10.1097/cji.0000000000000192
[5]http://gongyi.people.com.cn/n/2015/0513/c152509-26993061.html
[6]https://doi.org/10.1016/j.cryobiol.2012.01.004
