一、细胞培养最怕什么?

细胞污染！

很多同学遇到细菌污染，或是真菌污染，一般会毫不犹豫地选择把细胞丢弃。但是支原体污染和常见的细菌污染不同，支原体并不会直接破坏宿主细胞结构，而是改变细胞的代谢。所以，被支原体污染的细胞往往表现出生长状态变差，例如生长缓慢，但并不会像细菌污染那样大量死亡。要注意的是，支原体污染会改变细胞代谢，所以也会对许多细胞实验的结果产生影响！

所以支原体污染，细胞状态往往尚可，总让人想先救一救。

那么，要如何祛除细胞上的支原体污染呢？

先让我们了解一下支原体吧！

关于支原体

支原体，是一种没有细胞壁结构，在独立生活和细胞内寄生之间存活的原核生物，其结构和典型的细菌相近。支原体直径约180~350nm，比细胞小很多。据研究表明，约98％的支原体存在于细胞表面和细胞间隙。

图1 支原体结构图

自1898年由法国 E. Nocard 及 E.R.Roux 从肺疫牛隻中首次分离出支原体以来，已有超过180种支原体被发现，其中20多种能够感染体外培养的细胞，而目前生物实验室中95%以上的支原体污染均是其中6种引起的。

它们是：

1.来源于实验人员鼻腔、口腔，并经由飞沫传至培养细胞中的口腔支原体（M.orale）、猪鼻支原体（M.fermentans）及人型支原体（M.hominis）。

温馨提示

所以进行细胞实验时，要做好防护，口罩、手套、实验服一样都不能少哟！

2.来自牛血清的精氨酸支原体（M. Arginini）、莱氏无胆甾支原体（A. Laidlawii）、及来自猪源胰酶的猪鼻支原体（M. Hyorhinis）。

温馨提示

购买血清和胰酶时，也要注意选择无支原体污染的哟！

偷偷说一句：杜绝实验室支原体污染，我们实验员们人人有责呀！

1.支原体污染的细胞状态

增殖减慢；

上清液澄澈；

细胞形态异常（拉丝、铺展等）；

更换新的培养液细胞状态没有恢复。

2.如何去除支原体污染？

由于支原体尺寸比细胞小许多，98%的支原体存在于细胞表面和细胞间隙之间，所以我们采用反复悬浮冲洗和低速离心，是能够让大部分支原体与细胞分离的。

所以去除支原体污染就一句话：通过反复悬浮冲洗、离心，加上使用我们的支原体清除剂，即可在细胞培养四代以内有效地祛除大部分的支原体。

那么具体怎么操作呢：

首先把被支原体污染的细胞消化收集，放入干净的离心管内，低速离心（300~500r/min），弃上清。

注：不同细胞大小不同，适合的离心转速不同，可自行摸索尝试，选择保证大部分细胞收集下来的最小转速。

再加入干净的PBS悬浮冲洗细胞，低速离心，弃上清，反复清洗三次。

注：这样可祛除细胞表面60％~70％的支原体。

细胞加入含1‰ Bacteria Rid（货号：FH5001）的新鲜培养基，传代培养。

注：建议处理期间，细胞密度保持在50~60%。

此后每天使用PBS清洗，并换液。期间若细胞生长较密，则取培养上清进行支原体检测，并按照上面步骤进行传代。连续处理 3-6 天，即可清除大部分支原体污染。

注：若细胞污染非常严重，细胞状态不佳，建议提高Bacteria Rid（货号：FH5001）的浓度至2‰ ，并适当延长处理时间。

敲黑板，划重点啦！

1.每次传代时，重复三次对细胞悬浮冲洗步骤非常重要，操作要正确、规范，以 达最佳效果！

2.在培养基中加入1‰ Bacteria Rid（货号：FH5001）消灭残存的支原体，并抑制支原体增殖！

3.使用安全的血清、培养基等试剂，不再有新的支原体加入！

4.做到以上三点即可确保祛除支原体污染。

Bacteria Rid的工作原理是什么？

Bacteria Rid 是富衡生物研发的第三代支原体清除剂（货号：FH5001），主要用于清除细胞、血清、培养基中的支原体，同时对常见的细菌也有一定的清除作用。

主要成分为抗菌肽（AMPs）+穿膜肽（CPPs）。作用原理是支原体清除剂中的中的AMPs可以有效杀灭细胞外面的支原体和常见细菌，而CPPs可以携带AMPs进入细胞，清除细胞体内的支原体，让细胞彻底摆脱支原体污染的困扰，确保研究人员实验结果的可信度。

Bacteria Rid（货号：FH5001）