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各向异性结构决定了生物系统的引人注目的行为特性。例如，人类骨骼展示了软性胶原纤维和坚硬的羟基磷灰石（HAP）的重复且各向异性的组合。由于胶原提供了骨骼的柔韧性和弹性，而HAP则提供了硬度和强度，人类骨骼具有卓越的力学性能，其弹性模量约为20 GPa。为模仿这些自然特征，通过剪切力、电场、磁场、定向冰冻、离子扩散和三维打印技术等手段，已经发展出了多种基于水凝胶（HD）的各向异性结构。特别是这些各向异性模式已经在力学上加固了HD本身。此外，由于应力可以通过加入的强组分（例如玻璃状聚合物、纳米颗粒和石墨烯）进行缓冲，软性HD和强组分的各向异性模式将显著改善整个复合材料的物理特性。因此，对于软性HD和强组分的各向异性图案化技术对于先进的仿生和生物启发材料系统具有潜在应用前景。Lieasgang模式是沉积岩和砂岩中自然形成的自组织各向异性沉淀图案。科学家们发现，当矿物前体的扩散反应自组装在非平衡条件下进行时，会形成这种周期性图案。因此，最近的研究通过使用带电纳米颗粒、液态金属、Ag+沉淀、聚电解质和生物聚合物人工生成了Lieasgang模式。虽然Lieasgang的图案化方法已经部分确立，但很少讨论Lieasgang模式的具体优势。最近，Lieasgang模式被用作提高离子皮肤触觉传感效率的指纹技术，以及记录外部机械变化信息的手段。然而，Lieasgang模式如何决定材料的机械特性的机制几乎没有被揭示。
来自韩国中央大学的Sangmin Lee团队与来自韩国延世大学的Jinkee Hong团队合作揭示了Lieasgang模式可以引起非线性弹性。本研究制备了一种具有生物矿物-水凝胶重复层的Lieasgang模式复合材料。只有在过饱和条件下进行生物矿化时才能获得此Lieasgang模式复合材料。Lieasgang模式复合材料具有非线性弹性响应，而单层生物矿物壳的复合材料则呈现线性行为，从而证明Lieasgang模式在实现非线性弹性方面是至关重要的。坚硬的生物矿物层代表软水凝胶缓冲了集中能量，从而减轻了水凝胶组分的应力，进而使其能够持续地发挥弹性。此外，非线性弹性的Lieasgang模式复合材料对外部加载具有出色的应力松弛特性，这是软骨的生物力学特征。这种应力松弛使得纤维状Lieasgang模式复合材料束能够承受更大的变形。相关工作以题为“Anisotropic Liesegang pattern for the nonlinear elastic biomineral-hydrogel complex”的文章发表在2024年04月26日的国际顶级期刊《Science Advances》。
1. 创新型研究内容
本研究通过调节离子强度（I）来研究生物矿化动力学，以制备具有各向异性Lieasgang模式和非线性弹性的HAP-HD复合材料。生物矿化指的是使用富含Ca2+和PO43-的HAP前体进行HAP生长的现象。当离子强度低于临界值时，生物矿化形成了单层HAP包覆的复合材料（HSC）。这种HSC呈现出HD的典型弹性响应。相反，当离子强度超过过饱和点时，形成了具有Lieasgang模式的复合材料（LPC）。这种LPC呈现出类细胞和组织的非线性弹性行为。流变学研究和有限元分析（FEA）揭示了坚硬的HAP结构独特地承受了集中能量，代表了软性HD层。这种减少了HD组分中的应力，使其能够持续地发挥应力耗散和弹性。非线性弹性的LPC表现出出色的应力松弛能力，这也是软骨的生物力学特征。此研究报告了对Lieasgang模式的基本理解，以及一种获取具有广泛潜在生物医学应用的复合材料的简单技术。
【LPC 的制造和研究】
图1A展示了LPC的基于生物矿化的Lieasgang图案形成过程。首先，使用丙烯酰胺和海藻酸钠合成了双网络HD。特别地，离子交联剂Ca2+作为初始成核位点。丙烯酰胺网络主要作为对照组，具有明显的线性弹性，用于研究Lieasgang图案引起的LPC的非线性弹性。同时，据报道，丙烯酰胺网络对生物矿化动力学几乎没有影响，类似于其他惰性基质（如明胶，壳聚糖和聚乙烯醇-聚乙烯吡咯烷酮HD）用于Lieasgang图案形成。随后，HD被分别暴露于两个单独含有PO43-和Ca2+离子的HAP前体溶液中，以触发离子扩散、成核和沉淀。LPC的整个表面变得不透明，表明HAP壳层已经生长。根据C 1s X射线光电子能谱（XPS）光谱，与HD相比，LPC的C═O强度减小了31％，表明HAP已经充分生长。将LPC切成三等分，观察到HAP的Lieasgang图案（LP-HAPs）占据了HD的内部。此外，还识别出位于HAP壳层和LP-HAP之间的中间HD（inter-HD）和HD的内部核心（HD core）。因此，LPC呈现出各向异性的图案。对LPC进行了拉曼光谱分析，如图1B所示。值得注意的是，获得了Lieasgang图案的单元域的拉曼信号。HAP壳层区域呈现出强烈的峰值（960 cm-1），来自HAP的PO43-。与此同时，中间HD和HD核心区域在900到990 cm-1范围内没有显示任何峰值。LP-HAP展示了强烈的HAP拉曼信号。通过在HD核心-LP-HAP-inter-HD区域内进行镶嵌拉曼映射，可将该发现可视化（图1C）。这些拉曼实验证实，生物矿化选择性地发生在LP-HAP和HAP壳层区域，形成了Lieasgang图案内的明显边界。
图1 LPC 的特征
【以生物矿化为基础的各向异性李斯钢图案形成机制】
如图2A所示，生物矿化动力学在很大程度上取决于HAP前体介质的I值。通过HD网络的离子渗透是由化学势梯度驱动的，从而导致离子渗透深度与I之间呈正相关关系（图2A中的蓝线）。特别是，HD与周围介质之间的浓度差（Δc）确定了离子渗透通量密度（J）：J = P(Δc/L)，其中L是HD的长度，P表示渗透系数。此外，使离子团簇成熟到核大小所需的阈值能量应该满足成核和随后的生物矿化过程。因此，在HAP生长过程中，生物矿化速率呈现出初始的平台期，随后呈指数增长并最终饱和（图2A中的黄线）。迅速达到饱和点可能导致较小的HAP（图2A中的绿线）。总之，当I值增大时，离子渗透变得更容易，离子达到更深的位置，生物矿化速率加快，HAP的尺寸减小。鉴于过饱和意味着I值显著增加，与低至中等I值的普通HAP前体介质相比，生物矿化行为在过饱和条件下将是独特的（图2B）。当I值远低于过饱和点时，缓慢的离子通量导致浅层离子渗透深度，HAP逐渐从离子附着的成核表面生长并向核心扩散。因此，离子扩散的整个轨迹成为单一连续的HAP层（图2C）。当I值进一步增加时，离子渗透变得更强烈，形成更厚的HAP壳层。这种现象与报道的单层HAP壳层形成情景一致。
图2 生物矿化基于Lieasgang图案形成的机制
【Lieasgang图案形成机制的参数研究】
产生LPC的三个步骤是至关重要的，这三个步骤为：HD的预pH调整、生物矿化和后孵育（图3A）。生物矿化步骤中的收缩是成功Liesegang图案的指标。本研究探究了每个步骤的参数，以揭示Liesegang图案的详细机制。首先，如图3B所示，控制了生物矿化步骤：I值为0.033、0.33、3.3和33 M，生物矿化前体暴露次数（#）为5和10。先前的研究报告指出，增加#可以使HAP成熟，而不受短暂前体暴露时间的影响。此外，当I = 33 M时，表示制备了非平衡过饱和前体。在I = 0.033 M和# = 5的条件下形成了薄薄的HAP壳层。当I值为0.33 M，# = 5时，这个HAP壳层变得相对明显。当I达到3.3 M时，在# = 5的条件下观察到了明显的HAP壳层前沿边界。在I = 33 M和# = 5的条件下进行的生物矿化显示了HD间和LP-HAP形成的复杂结构。尽管这样的Liesegang图案到目前为止相对模糊，但是I = 33 M导致了一种与I = 0.033到3.3 M不同的独特各向异性结构。这些发现在进行# = 10的生物矿化时变得明显。通过在# = 10的条件下增加I值直到3.3 M，HAP壳层持续增长，直到在# = 5的情况下观察到的生物矿化前沿边界线。在I = 33 M和# = 10的条件下进行的生物矿化导致了成熟且明显的HAP壳层- HD间-LP-HAP-HD核心的Liesegang图案。总之，使用I = 0.033到3.3 M前体进行生物矿化会产生具有不同HAP壳层厚度的HSC 1到HSC 3，而只有在I = 33 M条件下才能选择性地获得LPC。特征区域的厚度如图3C所示。无论#的值如何，HAP壳层在I = 3.3 M之前变得越来越厚。当#从5增加到10时，HSC 1（I = 0.033 M）和HSC 2（I = 0.33 M）的HAP壳层厚度分别增加了255和183％。与此同时，I = 3.3 M条件只有112％的增加，说明在I = 3.3 M附近离子渗透速率达到了上限。考虑到I = 33 M和# = 5的条件，首次出现的LP-HAP和HD间的厚度值分别为0.18和0.06厘米。在形成Liesegang图案后，HAP壳层厚度与I = 0.33 M的情况相当。当#为10时，LP-HAP变厚了133％，而HD间的厚度与# = 5时的值几乎一致。
图3 对Liesegang图案形成中有影响的参数的分析
【LPC 的机械特性】
尽管有关具有HAP壳层 -HD间 -HAP核心结构的生物矿化复合材料的报道，但各向异性结构与力学性能之间的关系尚未揭示。本研究通过选择性生长前成骨细胞来证明图案化HAP的生物活性。本研究进行了流变学研究，以了解各向异性Liesegang图案与非线性弹性之间的关联。特别是，采用叠加流变学监测了在广泛变形范围内的储存模量（G'），其中G'代表弹性行为。对于一般的狭窄变形范围，线性和非线性弹性材料之间的G'曲线差异不太明显（图4A中的黑线）。同时，当几个G'曲线根据叠加理论在时间和温度的基础上水平平移时，线性和非线性弹性材料的主曲线将呈现显著差异（图4A中的红线）。在先前的研究中，通过叠加理论确定了在频率范围为0.1到100 rad/s内进行实验时，在频率为108 rad/s时外推的G'值。弹性材料呈线性增长的主曲线，而非线性弹性材料则显示出具有多个平台的曲线主曲线。时间-温度叠加主要用于此处，而时间-动力学和时间-湿度模型还额外用于特定目的。图4B到D展示了在频率扫描下在25℃到65℃范围内以5℃间隔测量的G'曲线的叠加拟合主曲线，其中水平平移因子（αT）遵循与阿伦尼乌斯方程相关的活化能。因此，本研究通过从零频复杂粘度测量激活能，从而确定了HD，HSC 1到HSC 3和LPC的αT值。
图4 对LPC的流变学研究
随后，本研究对HD、HSC和LPC进行有相同的5 N压缩力或21.25 N·mm扭转力的有限元分析（图5A）。如图5B和C所示，变形后的不同平衡轮廓表明，应力分布受Liesegang图案的显著影响。在压缩下的HD中，其质心比顶部和底部表面承受更集中的应力（图5B，左侧）。应力沿着方位角平滑增加，并在边界表面达到最大值，高达20.7 kPa。在HSC中也观察到类似的应力分布特征（图5B，中间）。尽管HAP壳层承受了更多集中的应力，最高可达26.0 kPa，但HSC的HD部分与纯HD呈现类似的应力分布。换句话说，HAP壳层的存在很少对HSC的应力分布特征产生积极影响。相反，LPC呈现出独特的应力分布特征，其中大部分应力偏向于LP-HAP（图5B，右侧）。对HD、HSC和LPC进行的扭转实验结果显示的应力分布特征与压缩试验相同（图5C）。
图5 使用有限元分析（FEA）研究Lieasgang模式的影响
【基于 LPC 的生物医学应用研究】
本研究展示了LPC在需要非线性弹性以获得满意结果的医学领域中的潜在物理优势。特别是，研究了LPC是否能够模拟结缔组织软骨的特征生物力学行为。由于其优越的应力松弛特性，软骨始终承受着压缩和剪切力，因此应力松弛被视为设计可靠的人工软骨的重要考虑因素之一。考虑到LPC源自其Liesegang图案的优异应力耗散特性，本研究进一步探究了其作为骨关节炎患者的人工指关节软骨的可行性（图6A）。在当前阶段，LPC并没有承担软骨的生物学功能，例如摩擦阻力。蠕变实验在恒定剪切应力（0.1 kPa）和保持时间100 s下进行。HD显示出弹性蠕变响应。同时，如图6B所示，LPC展示了粘弹性的变形和恢复，这也是在具有优异应力松弛特性的胶原蛋白和海藻酸盐凝胶中观察到的现象。此外，通过施加10%或20%的应变并保持1000 s来研究HD和LPC的应力松弛特性（图6C）。先前的研究发现，在1000 s内的松弛特性明显影响细胞活动，因为细胞通常对1 s内的物理环境变化敏感。无论施加的应变如何，HD在最初的100 s内保持了超过95%的应力作为弹性能量。相反，LPC在同一时间内有效地松弛了75%的应力。此外，LPC在终点时仅保留了70%的应力。图6D展示了HD和LPC的循环压缩实验，滞后回线与应力松弛相关。考虑到组织（包括软骨）的生理最大应变范围为30%至40%，压缩应变被施加到40%。值得注意的是，与HD相比，LPC展示了明显的滞后回线。此外，当循环次数增加时，LPC展示了增强的应力松弛效果（图6E）。这些结果验证了LPC在剪切和压缩方面的有效应力松弛能力，并表明其作为人工软骨以分散磨损应力的潜在潜力。
图6 利用LPC进行生物医学潜力的物理研究
2. 总结与展望
尽管LPC与软骨表现出类似的物理行为，但在当前阶段，LPC在替代软骨方面存在局限性。特别是，快速的HAP生物矿化可能导致简单的四层Lieasgang模式，从而限制了LPC的机械性能上限。同时，本研究团队预计这项研究的发现可能为实现替代软骨的材料提供线索。可以考虑广泛的沉淀组合，因为前体溶液的过饱和度决定了各向异性的Lieasgang图案。也就是说，精心设计的沉淀动力学可以导致具有多层先进Lieasgang模式的形成。考虑到即使是一个简单的Lieasgang模式也能显著影响LPC的整体机械性能，更复杂的Lieasgang模式可能会产生一种强大且非线性弹性的复合材料，适用于替代结缔组织。
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