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非临床测试依赖于具有生理相关性和高通量的体外细胞培养系统，以及模拟生理条件但在样本大小和维护方面存在挑战的动物模型。2D细胞基于的测定可以进行简单和大规模的实验，例如毒性评估，但在对器官或组织的全面形态和功能评估方面存在不足。相反，基于微流控的3D细胞培养可以精细地平衡这些考虑因素。基于微流控的系统可以设计成多种形式，以生成有关人类器官形态和功能特性的有价值的数据。共培养条件的生物学组成、物理化学刺激和生物分子传递使得可以利用人类细胞开发组织和器官的模拟。这种系统可以在一系列优化条件下进行高通量实验。高通量的3D微流体细胞培养系统可以设计成模拟人类组织和器官的方面，因此可以作为非临床评估工具。它们具有大规模生产、高通量、与自动化设备兼容、标准化分析和生成生理相关结果的优势。

来自韩国首尔大学的Noo Li Jeon团队综述了如何设计具有不同生物复杂性、细胞来源和细胞配置以及模拟人类组织的生理参数的微流体装置。本研究探究了标准化、可扩展性和自动化策略，并概述了高通量数据生成和分析方法，以解释微流体3D细胞培养模型的输出。最后，探讨了这些工具作为药物开发的非临床测试系统的潜力，并概述了设备设计和应用中的主要未来挑战。相关工作以题为“Microfluidic high-throughput 3D cell culture”的综述文章发表在2024年04月04日的国际顶级期刊《Nature reviews bioengineering》。

1. 本文要点

➢ 高通量的微流体3D细胞培养系统可能提供有价值的非临床测试工具。

➢ 在应用微流体技术进行细胞培养时，需要平衡生理相关性和高通量。

➢ 基于微流体技术的3D细胞培养模型可以根据所需的生物复杂性和输出水平进行设计和优化，以满足特定应用的要求。

➢ 自动化和人工智能可以辅助对3D微流体细胞培养装置进行标准化分析。

【生物复杂性】

生物复杂性在离体细胞培养研究中可以越来越多地得到实现；例如，对免疫疗法日益增长的兴趣推动了对肿瘤免疫微环境复杂性的探索。除了表征细胞形态学特征外，细胞的功能性质也可以在离体环境中进行评估，例如研究转移性癌细胞穿越血管壁的行为，或评估免疫细胞的细胞毒性能力。由于可扩展性，静态2D细胞培养方法仍然在临床前研究中普遍使用，包括细胞存活率、增殖和凋亡检测。然而，它们往往无法模拟体内的生物复杂性。相反，可以设计微流控的3D细胞培养和共培养系统，使人类细胞更接近模拟其体内环境。在这些系统中，通过小通道和腔室可以控制细胞环境，提供不同的化学和机械刺激。例如，可以编程控制3D细胞外基质中的流体流动方向，以研究间质流对血管生成活性的影响。微流控系统还可以在气液界面上培养极化上皮组织。此外，可以调整基质的刚度模量以与特定组织的刚度相匹配。然而，在3D微流控细胞培养系统中，高通量性、可定制性、可制造性、可重复性和设计修改仍然具有挑战性。为克服这些限制，可以应用激光加工和3D打印等加工方法，以实现细胞在体内样功能的重建。标准化的微尺度系统可以通过集成液体处理装置和高含量分析系统来提高实验的通量和可重复性。这些设备可以提供一个可扩展、可定制和高通量的平台，用于模拟体内生物复杂性的3D细胞培养研究（图1a）。

【目的驱动的设计】

高通量的3D细胞培养方法需要在多种条件下进行高效的筛选。原代细胞提供了对患者特定行为和响应的宝贵见解；然而，它们的可用性有限，而且在高通量应用中对其进行优化可能具有挑战性。相比之下，包括不同肿瘤类型的已建立癌细胞系在内的不朽细胞系具有可重复性和可扩展性，使其非常适合在微流控系统中进行高通量筛选。例如，可以足够增殖细胞系以高通量研究癌症生物学和药物反应。此外，干细胞，包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞（iPS细胞），能够生成患者特异性模型，以提高高通量筛选的生物学相关性。多能干细胞具有分化为各种细胞类型的能力，因此有助于在受控的微流控环境中研究发育过程和组织再生（图1b）。

可以使用器官样或细胞球体来模拟人类微生理环境（图1b）。器官样是从干细胞或组织前体细胞衍生的3D结构，可以部分复制特定器官的细胞多样性和空间组织。这些模型可用于研究器官发育、疾病病理学和药物反应。细胞球体是形成球状结构的紧密聚集体，缺乏器官样中所见的明显组织发育。然而，它们更容易构建，成本更低，因此在组织水平上作为3D模型具有很大的价值。因此，器官样和细胞球体提供了互补的方法，在体外模拟微生理环境。特别是，将其与微流控技术结合使用，可以再现生理学上的流体流动，并引入血管化以增加营养物交换和氧气供应。这种动态环境不仅提高了模型的准确性，还有助于研究器官发育和对刺激的反应。

微流控细胞培养装置中使用的水凝胶材料决定了3D细胞培养环境。水凝胶材料根据生物相容性、力学性能以及对细胞外基质（ECM）成分和结构的模仿程度而有所不同（图1b）。例如，胶原和明胶水凝胶具有生物相容性，类似于天然ECM，因此适用于细胞与基质相互作用至关重要的条件。另外，藻酸盐水凝胶具有可调节的力学性能和易于交联的特点，例如可以筛选机械信号对细胞行为的影响。除了天然水凝胶外，还可以在基于微流控的3D细胞培养中使用合成聚合物，如聚乙二醇和聚丙烯酸酯。这些合成水凝胶通常具有可调节的力学性能，具有高稳定性和融合多样功能基团的能力，从而能够精确控制细胞与基质的相互作用。然而，它们可能需要进行改性以改善细胞黏附性或包含生化信号。

为了保持细胞的生存能力和功能，可以在微流控系统中引入加热器或热电设备等温度控制元件，以维持恒定的温度。细胞的行为也受到pH变化的影响，因此可以实施pH传感器和控制器来监测和调节培养基的pH值。此外，可以设计气体渗透性膜或微通道来调节氧气和二氧化碳等气体浓度，以复制生理相关条件。在高通量的3D细胞培养模型中进行高效且可扩展的实验需要对微环境控制进行自动化和并行化处理。微流控系统通过集成机器人系统或气动控制器，实现对细胞、水凝胶和培养基的自动处理和操作，以简化细胞接种、水凝胶制备和培养基交换的过程。特别是，无泵模型消除了对外部泵的需求，实现了对多个样品的同时高通量处理（图1c）。

图1 微流控高通量3D细胞培养

【高通量细胞培养平台设计】

通过设备设计、制造方法以及自动化和数据收集与分析的实施，可以提高3D细胞培养平台的可扩展性和吞吐量。特别是，在进行实验和生成样品供分析的细胞培养平台应该经过精心设计，以提高吞吐量，包括细胞排列、生理因素的引入、环境的控制以及与自动化设备的兼容性。

可以通过在肺上芯片平台上拉伸多孔膜来模拟肺的呼吸运动（图2a）。在这个平台上，肺上皮细胞和微血管内皮细胞被培养在多孔膜的两侧，从而模拟肺泡的扩张-收缩运动。拉伸是通过在微通道的两侧施加真空来实现的，多孔膜垂直地分隔了内皮细胞层和上皮细胞层。应用的应变水平范围从5%到15%，与体内整个肺泡中观察到的正常应变非常接近。在微流控重建的小气道中，可以展示主要人类中性粒细胞在生理流体和剪切应力（1 dyn cm−2）作用下对炎症因子的反应行为。

人体组织的生化特性可以通过不同细胞类型在3D环境中的相互作用以及化学信号、氧气或营养物质的梯度来复制（图2a）。在微流控平台中，可以通过将不同细胞类型定位在离散但相连的水凝胶块中来研究细胞间的相互作用。例如，可以使用微柱阵列构建一个3D血管生成模型，该模型通过将一个无细胞的纤维蛋白凝胶置于中间通道中，将含有成纤维细胞的纤维蛋白凝胶置于侧通道中，其中成纤维细胞可以释放生长因子。微柱阵列附着在无细胞基质的远侧的内皮细胞上。然后，内皮细胞朝着成纤维细胞形成有腔结构的芽，沿着释放的生长因子的方向生长。在这里，可以通过集成外部泵或使用静水压力来实现动态条件。类似地，一个作为毛细血管阀门的凸起结构使内皮细胞能够与星形胶质细胞和血管平滑肌细胞共培养，从而形成重现血脑屏障的紧密内皮细胞连接。

在微流控细胞培养平台中，可以越来越多地实现生物复杂性，而不影响吞吐量，从而为某些应用提供了动物模型的替代方案。例如，可以在微流控PDMS装置中设计一个血管生成模型（图2b）；在这里，将水凝胶溶液注入中间通道，随后在水凝胶上培养人脐静脉内皮细胞86。位于通道之间的微柱阵列引导水凝胶溶液填充中间通道，同时防止其泄漏到相邻的通道中。相同的通道布局可以用于内皮细胞和癌细胞的共培养，以模拟有血管的肿瘤微环境。

图2 微流控3D细胞培养平台的设计考虑因素

为模拟组织功能，需要进行机械或化学刺激，并进行培养基的循环和交换。例如，可以通过将培养基注入插入装置端口的移液管尖端来施加液压压力，以产生流动。随着培养基流入液压水平较低的尖端，压力会降低；因此，需要添加培养基来维持连续的流动。另外，泵系统或自动液体处理器可以用于多器官模型，特别是用于涉及多个器官模型的情况。在这样的模型中，需要根据器官的大小来调整器官模型之间共享的化学成分。自动液体传送系统可以用于将流体从一个器官模型分配到另一个器官模型；例如，已有商业化的细胞培养模块可用于肺和肠道模型，生成周期性拉伸运动、培养基流动和更换。这种自动化过程可以提高实验的吞吐量和可重复性。

2. 总结与展望

高通量的3D微流控细胞培养模型可以设计具有高生物相关性，例如通过应用iPS细胞和器官样体，以及具有生理相关的培养条件。这样的设备可以通过多种方法进行设计，包括3D打印、激光加工和注塑。例如，一种3D混合微网格辅助生物打印方法结合了微网格支架结构，这些结构是通过数字光投影进行3D打印的，以及顺序水凝胶图案化。这种方法可以实现精确的3D液体图案化，无需外部泵或阀门，并可管理流体的排除。通过在设备的不同部分定位不同的水凝胶，通过提供可将水凝胶溶液固定在指定单元内的单元式支架，也可以对3D组织形态发生进行空间引导。这种MultiCUBE方法允许对水凝胶的生物分子组成和物理条件以及生物样本的相对位置进行空间组织，并且可能适用于多器官模型。许多设计和操作3D微流控细胞培养系统的方法主要关注于重现生理组织的结构和功能，通常较少强调测试测定和读数。

使这些系统成为药物和非临床测试的标准工具，并符合OECD测试指南，就必须考虑系统与常见实验室仪器进行数据采集和下游分析的兼容性。例如，微流控细胞培养装置可以进行各种评估，包括表型、基因组学、蛋白质组学和组织学分析。然而，多组学分析仍然具有挑战性。例如，从微流控装置中提取水凝胶以获取组织或细胞可能会导致损伤。因此，设备设计必须适应此类分析。例如，可以考虑使用允许可逆组装的连接技术或材料。此外，基于开放式微流控的模块化装置可以便于接触细胞或组织。如果这些装置内部的接口是高通量的，那么在相同的实验条件下，可以同时获取经受相同实验条件的样本，以提供足够的样本量进行多组学分析。除了生物学的有效性，还应考虑到3D微流控细胞培养模型的实际应用，即所需的复杂性水平。例如，在药物开发中的细胞培养模型应对新药候选物提供可靠的响应，并以高通量方式运行，但可能不必模拟整个器官或组织。因此，复杂性和通量可能需要平衡。

此外，需要改进设备的生产力、实验通量和数据分析效率，以适应特定的使用环境。微流控3D细胞培养已经达到技术成熟水平，并通过进一步将微型化的微流控与包括控制流动在内的生理参数进行整合，可以设计出在96孔板和384孔板尺度上操作的标准化微流控系统，实现实时监测。此外，模块化装置结构可以帮助从装置中取回细胞或组织进行高内容分析。高通量的微流控3D细胞培养模型因此可以为非临床测试提供重要数据，为模拟人类健康和疾病提供一种补充工具，与动物模型相辅相成。

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