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基于水两相乳液(ATPE)的生物墨水是生物打印的一项创造性创新，能够制造具有大孔结构的复杂3D细胞负载水凝胶，从而促进支架内的细胞活动。然而，这些生物墨水本质上缺乏稳定性和特定的生物功能，可能限制它们在靶向组织工程中的应用。
针对此问题，来自芬兰埃博学术大学的Xiaoju Wang/Tuomas Näreoja团队将低于0.1%的磷酸化纤维素纳米纤维(pCNF)引入基于葡聚糖/甲基丙烯酸明胶(GelMA)的ATPE系统中，用于基于挤出的前成骨细胞生物打印细胞制造具有成骨分化潜力的大孔水凝胶（图1）。水凝胶内的有序界面促进了体外宏观生物矿化结节的形成。
相关研究成果以“Bioprinting Macroporous Hydrogel with Aqueous Two-Phase Emulsion-Based Bioink: In Vitro Mineralization and Differentiation Empowered by Phosphorylated Cellulose Nanofibrils”为题于2024年3月14日发表在《Advanced Functional Materials》上。
图1 p_ATPE生物墨水进行生物打印过程的示意图
1. 水凝胶墨水的设计、流变特性以及机械特性
为了深入了解pCNF分配行为，对基于ATPE的墨水进行了共焦显微镜分析（图2a、b）。当使用含有约150 mm NaCl的PBS制备基于ATPE的墨水时，产生了透明乳液（图2a(i)），并在GelMA（红色）相中形成了单独的葡聚糖（绿色）微滴。通过将GelMA溶解在pCNF分散体中，然后将其与葡聚糖溶液混合来引入pCNF后，GelMA和葡聚糖相之间的相分离仍然存在，如图2a(ii-iv)所示。与在PBS缓冲液中制备的油墨相比，在HEPES缓冲液中制备的基于ATPE的油墨表现出更小的葡聚糖液滴尺寸（图2b(i)）。作者进一步研究了墨水制备过程中溶解成分的顺序，以确定它是否会影响pCNF分配行为。结果表明，即使pCNF最初溶解在葡聚糖中并随后与GelMA溶液混合，pCNF最终也会迁移到GelMA相。在生物打印中，带负电荷的pCNF在低离子强度下与GelMA相的结合保留了p_ATPE墨水的大孔形成能力，如图2b(v)所示。
图2 水凝胶墨水的设计
生物墨水的流变特性在决定其在生物打印中的整体性能方面发挥着关键作用，特别是基于挤出的生物打印应满足剪切稀化、快速恢复和即时交联响应性等一系列流变特性。GelMA的热依赖性溶胶-凝胶转变对于生物打印非常有益，并且基于ATPE的墨水也保持了这些特性（图3）。作者进行了全面的流变表征，以研究pCNF对葡聚糖/GelMA ATPE油墨流变特性的影响。总的来说，pCNF作为一种有效的流变改性剂和ATPE稳定剂，可以有利于ATPE生物墨水的生物打印和生物打印后过程。为了证明p_ATPE墨水在基于挤出的3D打印中的可打印性和打印保真度，使用Lp_ATPE墨水制造了复杂的厘米级3D结构（图3g-i）。
图3 水凝胶墨水的基本特性
为了研究pCNF对水凝胶机械性能的影响，作者测试了水凝胶圆柱体的压缩应力-应变曲线。ATPE水凝胶表现出比块状水凝胶更高的杨氏模量和最大应力（图4c），这主要是由于GelMA交联密度增加所致。pCNF上的表面磷酸基团为p_ATPE水凝胶提供了与生物系统中存在的二价阳离子进一步交联的机会。作者研究了Ca2+与pCNF交联(Ca2+(X))对机械性能的影响。如图4a-e所示，Ca2+(X) p_ATPE水凝胶的机械性能与非交联水凝胶保持相似的趋势，Ca2+(X) Mp_ATPE水凝胶的最大应力和韧性略有增加至276.5±52和分别为30.5±4.6 kPa（图4c、e）。在循环压缩测试中，所有水凝胶在重复压缩100次循环后都表现出很强的恢复原始形状的能力，卸载曲线恢复到原始点（图4g）。图4h证明了基于ATPE的水凝胶的大孔结构形成能力，其中本体水凝胶呈现出平坦且致密的结构。此外，随着pCNF的加入，p_ATPE水凝胶中的沉淀速度大大增加（图4i），并且在p_ATPE水凝胶中观察到Ca/P复合物的片状结构。
图4 水凝胶的机械性能
2. 生物墨水的生物相容性
为了确认p_ATPE水凝胶的生物相容性，特别是pCNF对细胞活力、扩散和增殖的影响，作者对p_ATPE水凝胶进行了CCK-8测定。CCK-8表明ATPE水凝胶表现出增强的生物相容性，这归因于其大孔结构有利于细胞铺展和传质。为了评估生物打印后的细胞活力，我们对生物打印的水凝胶进行了活/死染色，如图5b所示。p_ATPE水凝胶显示出显着更高的活力(超过 90%)，进一步证实了p_ATPE水凝胶内细胞的快速恢复。细胞均匀分布在整个生物打印的水凝胶中，并且随着培养时间的增加而增加（图5e）。细胞骨架染色（图5f）进一步验证了培养7天后MC3T3-E1在生物打印水凝胶中的扩散。生物打印MC3T3-E1细胞的代谢活性和活力表明，pCNF显着增强了ATPE生物墨水的细胞相容性，并在整个生物打印过程中创造了合适的环境，促进了封装细胞的细胞活性。
图5 水凝胶和生物打印的细胞相容性分析
3. 生物墨水的体外成骨能力
接着，为了评估生物墨水的骨诱导性，在没有额外成骨刺激的正常培养基中培养的生物打印MC3T3-E1细胞中测量了碱性磷酸酶（ALP）酶活性（早期成骨分化的指标）。如图5d所示，生物打印水凝胶的ALP活性在第7天时没有显着差异。然而，到第14天，所有水凝胶中细胞的ALP活性均有所增加，而且，这种增加在p_ATPE水凝胶中显着更高与本体水凝胶和ATPE水凝胶相比，表明pCNF具有显着的成骨刺激作用。
随着ATPE水凝胶中加入pCNF，当水凝胶进行Ca2+交联时，细胞的矿物质形成略有增强，大的多细胞矿化结节的形成证明了这一点（图6a(ii)和(iii)）。Ca2+交联的pCNF网络促进了生物矿化的结节形态（图6）。这些结果表明，当所有诱导剂、pCNF、Ca2+交联和OM处理协同应用时，会发生最强的生物矿化。
图6 ECM矿化检测
综上，本文提出了一种掺入pCNF的葡聚糖/GelMA ATPE生物墨水系统，用于MC3T3E1细胞的基于挤出的生物打印，以制造促进矿化和成骨分化的大孔水凝胶。pCNF在低离子强度缓冲液中选择性地分配到GelMA相中，并形成物理缠结网络，这显着增强了ATPE生物墨水的稳定性，而不阻碍大孔的形成。pCNF的加入可以改善流变特性，有利于ATPE生物墨水的生物打印过程。pCNF上丰富的表面磷酸盐充当局部成核中心，并在少量存在时加速水凝胶内的生物矿化。总体而言，pCNF极大地增强了ATPE生物墨水的整体性能，并赋予其在体外3D骨模型工程中的潜力。
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