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近年来，人们越来越强调对安全和高质量生育保护的需求，这对于面临各种医学、非医学和个人情况的妇女来说成为了一项重大挑战。其中，被诊断为癌症的妇女构成了一个显著的群体，约有10%的癌症患者年龄在45岁以下。每年在美国有近20万处于生育年龄的人被诊断为癌症患者。这些年轻的癌症患者通常急切希望保留自己的生育能力。尽管先进的癌症治疗方法，如化疗、放疗和手术，大大提高了患者的存活率，但它们也带来了诱发卵巢早衰（POF）的风险。显然，在开始癌症治疗之前解决生育保护问题对于这些情况至关重要。非肿瘤性疾病，包括自身免疫性疾病、血液疾病和骨髓移植的需要，也需要进行化疗和放疗等治疗。由于卵巢的敏感性，这些治疗造成的POF风险非常高。此外，越来越多的妇女选择推迟生育出于社会或个人原因，因此增加了她们患POF的风险。在动物科学领域，卵母细胞的冷冻保护也是生物繁殖和生物多样性保护的关键过程。因此，开发高效而安全的女性生育保护方法对于应对未来几年即将面临的挑战至关重要。

来自中国科学技术大学的赵刚团队与来自安徽医科大学的刘寰忠、曹云霞团队合作开发了一种多尺度冰抑制平台，能够在全周期内对小鼠卵母细胞进行低温保护。该平台利用纳米材料和微流控技术，实现了高效的冰抑制和温度控制，在冷冻和解冻过程中保护卵母细胞的完整性和生存率。研究结果表明，该平台能够显著提高小鼠卵母细胞的冷冻解冻成功率，并提供了一种可行的方法来保护卵母细胞在低温条件下的生物功能。相关工作以题为“Multi-Scale Ice Inhibition Platform Enables Full-Cycle Cryogenic Protection for Mouse Oocyte”的文章发表在2024年04月08日的国际著名期刊《Advanced Functional Materials》。

1. 创新型研究内容

这个多尺度冰抑制平台能够在整个冷冻-解冻循环中精确地抑制冰损伤，并使用低浓度的渗透性保护剂（相比商业方法减少了35.4%，而且不含DMSO）实现批量冷冻保存卵母细胞，具有显著的存活率、功能性和可扩展性。根据图1a所示的冷冻保存程序，本研究的多尺度冰抑制平台使用低浓度的渗透性保护剂（3.1 M EG）实现了高效率和批量卵母细胞冷冻保存。如图1b所示，低浓度的渗透性保护剂通常会导致显著的细胞外冰损伤。相反，高浓度的渗透性保护剂可以通过防止水合作用来减轻冰损伤，但由于对生物样本产生严重的生化毒性，它们也引入了潜在的安全风险。因此，在冰损伤和渗透性保护剂的生化毒性之间解决冲突仍然是一项具有挑战性的任务。如图1c所示，为了实现低浓度渗透性保护剂的高效存活率，本研究开发了具有全周期低温保护功能的一体化PFG NPs：1）通过中观尺度的NPs降低过冷度并精确控制冰晶形态，在冷却过程中；2）由于PVA的羟基与冰晶分子的立体和几何匹配，通过分子氢键抑制冰再结晶；3）通过双重物理场确保充分均匀的回温，从而防止非晶转变和热应力。与传统的渗透性保护剂（TCPA）配方相比，我们的方法通过大幅减少35.4%的渗透性保护剂使用了单一的低毒性渗透性保护剂（仅使用EG而不使用DMSO），从而实现了生物相容性的生育冷冻保存系统。这导致了更高的卵母细胞存活率（98.6%）和批量卵母细胞冷冻保存（每个程序10个卵母细胞）。重要的是，PFG组在冷冻保存后显示出较少的基因变异，凸显了本文方法的生物安全性。恢复的卵母细胞保留了完整的功能，包括受精能力、发育能力和正常后代出生能力。本研究提出了一个多尺度冰抑制平台，并强调其在实现高质量卵母细胞冷冻保存中的全周期保护作用。这一突破为女性生育力的安全、高效和可扩展的保存开辟了新的途径。

图1 卵母细胞的冷冻保护程序概述及多尺度冰抑制平台的示意图

【多尺度冰抑制平台的开发】

为了在整个冷冻-解冻循环中实现冰抑制，设计了一种受生物启发的双物理响应纳米颗粒（NPs）。NPs的制备过程如图2a所示。首先，使用共沉淀法制备了Fe3O4纳米颗粒，并使用透射电子显微镜（TEM）进行了表征。Fe3O4的表面具有吸引OH和H+离子的性质，使得PVA可以通过形成PVA的-OH基团与Fe3O4表面吸附的-OH基团之间的氢键来装饰在Fe3O4上。2D石墨烯（GO）纳米片具有高比表面积，为微小磁性纳米颗粒的沉积提供了充足的接触点。此外，GO上丰富的负电功能基团，包括羟基、羧基和环氧基，有利于通过静电吸附将含有Fe3+和Fe2+离子的PVA/Fe3O4纳米颗粒附着在其表面。为研究不同构建的PFG NPs配方对冰抑制性能的影响，合成了三种不同比例的PFG纳米颗粒，其中PVA/Fe3O4与GO的质量比分别为1:2、1:1和2:1。这三种纳米颗粒分别被称为PFG-1、PFG-2和PFG-3。

图2 PFG NPs的设计及其在冷却阶段的冰抑制功能

【PFG纳米颗粒在冷却阶段抑制过冷和冰晶形态】

如图2c所示，与纯Trehalose（Tre）溶液相比，在50℃ min−1的冷却速率下，含有三种PFG纳米颗粒（2 mg mL−1）的Tre溶液的冰冻温度增加了约5℃。这个观察结果证实了所有三种PFG纳米颗粒表现出的催化成核功能。此外，研究了不同浓度的PFG-2纳米颗粒对Tre溶液冰冻温度增加的影响。值得注意的是，较高浓度（2和3 mg mL−1）产生了更显著的效果（图2d）。进一步探究了在不同冷却速率下的冰成核温度，如图2e所示。显然，在快速冷却速率下，特别是在100℃ min−1下，纳米颗粒的促进效应更为显著，导致温度增加高达10℃，从而诱导出更小的过冷温度（图2f）。最重要的是，观察到Tre溶液在100℃ min−1的冷却速率下，无PFG纳米颗粒存在时的冰晶形态，如图2g所示。纯Tre溶液在边缘处形成针状冰晶，而添加PFG纳米颗粒则导致更平滑的冰晶形态。这一观察结果凸显了PFG纳米颗粒在冷却过程中的冰抑制能力，这是降低卵母细胞冷冻保存中由冰晶引起的机械损伤的关键因素。

【PFG纳米颗粒在回温过程中限制红外线辐射、温度梯度和非晶化现象】

在冷冻保存过程中，另一个导致致命损伤的关键因素是红外线（IR）损伤，尤其是在解冻阶段。为了评估PFG纳米颗粒对IR现象的影响，本研究进行了一个“挤压冷却”实验，如图3a所示。光学图像显示，在−8℃退火30分钟后，出现了典型的冰晶结构。相比之下，添加PFG纳米颗粒减小了冰晶的晶粒尺寸（图3b）。在这些组中，与纯Tre组相比，三种PFG纳米颗粒的平均最大晶粒尺寸（MLGS）分别减小了49.2％、62.5％和61.6％（图3c）。考虑到PVA的分子结构，羟基团在2.92 Å的精确间距与一次和二次冰面之间的距离非常接近，分别为2.76和2.74 Å，实现了精确的分子排列。此外，还研究了不同浓度的PFG-2纳米颗粒对IR限制的影响，如图3d所示。较高的PFG-2浓度表现出优越的抑制冰晶形成的性能，与Tre组相比，IR减少了近50％。然而，定量结果表明，较高浓度（2和3 mg mL−1）的MLGS趋势没有显著差异，可能是由于浓度饱和，当使用过量的纳米颗粒时会导致聚集。还研究了其他参数，如解冻速率、冷却温度和解冻温度，以评估PFG纳米颗粒的抑制冰晶生长能力（图3e，f）。较低的退火温度和更快的解冻速率通过影响微小冰晶的传播和准液态扩散来限制冰晶生长。初始淬冷温度可能会影响PFG纳米颗粒在冰水界面的扩散系数。通常，冰抑制剂在水-冰界面的分布均匀性会极大地影响它们的活性。本研究推测，在−60℃的较高淬冷温度下，可能没有足够的扩散能力，这可能是由于均相冰成核的部分发生和随之而来的较大冰晶生长。相反，当冷却温度为−70℃时，PFG纳米颗粒可以均匀吸附在冰界面，并进一步阻止水分扩散到冰表面，显示出较高的IR抑制活性。此外，淬冷温度的差异将导致冰分子的初始能量状态的变化，这可能最终影响冰晶的晶粒。综上所述，这些数据突显了多尺度冰抑制平台在解冻过程中抑制IR的能力。

图3 PFG NPs在回温阶段抑制冰再结晶

温度梯度反过来会导致热应力，最终导致细胞死亡。此外，非晶化现象在传统对流传热过程中可能导致冷冻损伤的风险。为解决这些问题并提供有效的解决方案，将磁感应加热（MIH）和激光诱导加热（LIH）结合在多尺度冰抑制平台中，实现在回温过程中的双重物理场响应，同时提供快速均匀的回温特性。红外图像显示了LIH-MIH条件下的温度分布图（图4a）。随着MIH和LIH的强度增加，溶液温度也上升，而LIH-MIH的组合进一步提高了温度。为定量评估解冻效果，加热曲线显示MIH和LIH同时应用时，从液氮温度到生理状态温度的解冻速率更快（图4b）。为分析回温过程中管内温度分布，首先评估了不同温度下PFG-2纳米颗粒的比吸收率（SAR）。与传统的对流传热方法（水浴）相比，MIH和LIH加热的组合导致生物样本的回温更加均匀，这一点在热力学模拟结果中得到了证实（图4c）。因此，LIH-MIH加热方法有望减少冷冻保存过程中由热应力引起的冷冻损伤。此外，温度和回温速率分布的定量分析曲线进一步支持MIH和LIH的优越性（图4d，e）。值得注意的是，本研究的管中心温度的模拟结果与实验结果一致，验证了热力学模型的准确性。

图4 PFG NPs在回温阶段抑制温度梯度和非晶转变

【多尺度冰抑制平台实现了高效和批量冷冻保存小鼠MII卵母细胞】

本研究探索了不同浓度的PFG-2纳米颗粒以评估冷冻保存效率，结果表明2 mg mL−1的PFG-2纳米颗粒提供了最佳的立即卵母细胞存活率。还探究了卵母细胞与PFG纳米颗粒孵育不同时间后的存活率，并观察到与新鲜组相比，处理组的毒性最小。重要的是，解冻后，可以通过磁性完全除去PFG纳米颗粒，在TEM中没有发现纳米颗粒存在于卵母细胞内。值得注意的是，PFG纳米颗粒的活性冰抑制能力，结合其双重物理场响应，通过荧光染色结果显示，协同增强了小鼠MII卵母细胞的冷冻保存效率（图5a）。相比之下，死亡的卵母细胞显示出明显的宏观结构破坏，而活着的卵母细胞具有光滑圆形的卵膜（图5b），表明冰晶形成和生长导致的有害损伤。此外，对于TCPA方法，通常每次冷冻保存过程中只放置一个卵母细胞在Cryotop装置上，这是为了确保在冷却过程中的完全玻璃化。由于PFG纳米颗粒的多尺度冰抑制效应，卵母细胞冷冻保存系统大大减少了对玻璃化的依赖，从而实现了使用管子进行卵母细胞批量冷冻保存（图5c）。定性地说，当在MIH和LIH条件下使用2 mg mL−1的PFG-2纳米颗粒时，小鼠MII卵母细胞的存活率达到98.6％，与传统方法相当（图5d）。

图5 冷冻保存后小鼠MII卵母细胞的存活性和功能特性评估

【冷冻保存后小鼠MII卵母细胞的基因表达谱分析】

回收的小鼠卵母细胞中RNA的完整性对其后续的受精、发育和后代的健康至关重要。为了探究这一点，使用RNA测序技术对解冻的卵母细胞的RNA转录组进行了分析。将结果与新鲜卵母细胞组进行比较，观察到TCPA组中有996个基因上调和400个基因下调。相比之下，PFG方法只导致了85个基因的上调和下调，表明本研究的多尺度冰抑制平台对基因表达的影响比TCPA方法更轻微（图6a）。此外，火山图显示，使用TCPA的卵母细胞中的基因变异比使用PFG纳米颗粒的卵母细胞更为显著，只有25个基因在两种方法之间共享（图6b-d）。图6e展示了TCPA组中与新鲜组和PFG组相比的前50个差异表达基因。值得注意的是，其中17个基因（用红色标出）与线粒体功能、纺锤体结构和卵母细胞生育力相关，表明高浓度冷冻保护剂的不良影响。此外，与线粒体、跨膜蛋白、异常受精、钙信号调节和细胞周期调节相关的基因也表明了TCPA方法的负面影响。

图6 对恢复的小鼠MII卵母细胞的基因表达谱进行评估

【评估冷冻保存的小鼠MII卵母细胞的受精、发育和后代出生能力】

为评估回收卵母细胞的发育潜力，进行了体外受精（IVF）实验。通过可视化监测整个发育过程，从2核形成到囊胚阶段（图7a）。值得注意的是，新鲜组、TCPA处理组和PFG处理组的胚胎表现出类似的形态特征。包括2核、2细胞、4细胞和囊胚形成在内的关键阶段的发育率定量分析进一步凸显了PFG策略的有效性（图7b）。值得注意的是，与迄今为止的其他研究相比，本研究的方法在冷冻保存后以无DMSO和低浓度透过性冷冻保护剂的方式实现了最高的囊胚率（图7c）。还通过将2细胞胚胎移植到代孕小鼠中评估了体内受精卵的发育潜力。从这些移植胚胎中出生的后代表现出正常的生长和发育（图7d）。定量分析显示，冷冻保存的小鼠卵母细胞的出生率略低于新鲜组，而PFG处理组和TCPA处理组之间没有显著差异（图7e）。此外，从新鲜组、TCPA处理组和PFG处理组的卵母细胞转移的受精卵的生殖能力相似，如图7f所总结的。总的来说，这些发现表明，使用多尺度冰抑制平台冷冻保存的小鼠卵母细胞能够保持正常的受精、发育和生育后代的能力。

图7 冷冻保存的小鼠MII卵母细胞的体外受精、发育和新生后代能力评估

【对首代成年小鼠进行行为评估】

为评估小鼠卵母细胞的冷冻解冻过程是否对后代的行为产生影响，进行了综合分析，包括对总体运动情况（开放场测试）、识别记忆（物体识别测试）和绝望行为（尾悬测验）的评估。在开放场测试中，PFG冷冻保存卵母细胞的后代与新鲜组相比，从轨迹模式、总移动距离、休息时间、平均速度和核心区停留时间的测量结果来看，没有明显差异（图8a-e）。同样，在物体识别测试中，PFG组和新鲜组的后代在识别记忆方面没有明显差异。这可以从训练和测试阶段的总移动距离分析中得出结论（图8f,g）。此外，PFG组在熟悉和新颖物体上所花时间的定量结果与新鲜组非常相似（图8h,i）。PFG组和新鲜组的偏好指数（PI）和区分指数（DI）值也保持一致（图8j）。此外，PFG冷冻保存小鼠卵母细胞的后代在尾悬测验中没有表现出增加的静止时间，表明其行为反应正常（图8k）。总的来说，这些结果表明，基于多尺度冰抑制平台冷冻保存的卵母细胞所产生的首代小鼠表现出正常的行为，表明该保护过程的安全性和完整性。

图8 对第一代成年小鼠进行行为评估

2. 总结与展望

总之,本研究开发了一个多尺度冰抑制平台，该平台在小鼠卵母细胞冷冻保护的整个冷冻-解冻过程中集成了微观、中观和宏观的冰抑制措施。该平台使得冷冻保存的小鼠卵母细胞表现出卓越的存活率和质量。利用3.1 M渗透性保护剂，这个多尺度冰抑制平台能够实现高质量的小鼠卵母细胞冷冻保护。恢复的卵母细胞与采用传统方法保存的细胞相比，基因变异较少，同时保持了其完整的受精潜能、胚胎发育和成功的后代出生能力。本研究希望这个提议的多尺度冰抑制平台能够展示在建立专门用于生育保护的冷冻库方面的重要潜力。

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