Bioreactor Technologies for Enhanced Organoid Culture是《INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES》上的一篇文章，介绍了用于类器官培养的生物反应器，包括搅拌式、微流体、旋转壁容器和电刺激四类。搅拌式生物反应器通过改善氧合和实现适当的谱系进展来促进类器官培养，但存在流体剪切力和叶轮不稳定性等局限。微流体生物反应器能精确调节微环境，但制造困难、成本高且维护复杂。旋转壁容器可模拟微重力，用于细胞培养和类器官分化，但操作要求高。电刺激生物反应器可促进可兴奋组织类器官的分化和成熟，但缺乏媒体混合或流体流动。

*本文只作阅读笔记分享*

一、引言

近年来，类器官在研究组织发育、药物发现和临床应用等方面的作用日益凸显。传统的单层细胞培养难以准确模拟人体组织的结构和功能，而类器官能更好地重现天然组织的部分结构和功能。本文介绍了用于类器官培养的四种生物反应器，包括搅拌式生物反应器（SBR）、微流体生物反应器（MFB）、旋转壁容器（RWV）和电刺激（ES）生物反应器。

二、搅拌式生物反应器（SBR）

2.1 原理和特点

SBR的操作原理与传统大规模生物反应器相似，由圆柱形培养容器和搅拌器组成。

轴向和径向流叶轮产生流体动力，其配置、旋转速率和容器几何形状影响流体动力学特性。

SBR培养具有均质环境、简单监测和易于控制关键培养参数等特点，且具有可扩展性。

2.2 优势

2.2.1 改善组织氧合：

Li等的研究表明，在二维造血干细胞和祖细胞培养中，使用SBR可减少氧化应激，提高细胞存活率并加速分化。

Lancaster等的研究显示，SBR改善了氧供应和营养吸收，生成了更大、更连续的复杂脑类器官。例如，在他们的实验中，使用125 mL 旋转瓶成功生成了表达神经元和特定脑区标志物的类器官。

2.2.2实现适当的谱系进展和3D空间组织：

Qian等通过定制的旋转生物反应器，改善了氧和营养物质的扩散，促进了大脑区域特异性类器官的形成。在他们的研究中，使用与12孔板结合的定制迷你化旋转生物反应器（Spin），生成了特定脑区的类器官。

Fluri等的研究表明，在悬浮培养中从体细胞衍生iPSCs时，使用搅拌烧瓶可消除对饲养细胞层、血清或昂贵的组织培养底物的需求。例如，在他们的实验中，将诱导性次级小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）接种在处理过的搅拌烧瓶中，通过搅拌培养，成功衍生出iPSCs，且这些细胞与传统单层培养的细胞具有可比性。

2.3 类型和可定制性

常见类型如旋转瓶，可促进氧气和营养物质在培养基中的混合，减少浓度边界层。

可进行修改，如增加连续灌注营养供应、去除废物、集成传感器探针、pH控制系统和采样端口等功能。

例如，Qian等使用齿轮操作的搅拌平台组装改进的脑区域特异性类器官，该反应器（SpinΩ）包含十二个连接在齿轮上的叶轮，由单个电机驱动，且几乎所有3D打印部件均在内部使用3D打印制造。

Schneeberger等使用100 mL 旋转瓶大规模生产hiPSC衍生的肝脏类器官。在他们的研究中，将从患者肝脏活检中分离的单个细胞在旋转瓶中培养，形成肝脏类器官，通过mRNA测序和组织学染色表明，与静态培养相比，旋转瓶培养的类器官中肝细胞标志物上调，干细胞标志物下调，且形态更折叠，功能更成熟。

2.4 局限性

流体剪切力和叶轮不稳定性可能对剪切敏感的类器官培养产生影响，如Ovando - Roche等的研究发现，SBR虽然改善了视网膜类器官的层状分层并增加了纤毛感光细胞的产量，但导致了脆弱的晚期外节段样结构的损失。

定制和3D打印系统如SpinΩ可能存在技术困难，复杂性增加可能导致终端用户使用难度增大。例如，SpinΩ后期研究改进为Spin∞，以解决一些灭菌和可靠性问题。

三、微流体生物反应器（MFB）

3.1 原理和特点

MFB由一个或多个入口、小通道、腔室和出口组成。

使用微制造技术定制设计，建筑特征范围从毫米到微米尺度。

3.2 功能和应用

通过泵使流体通过通道和腔室，入口和输出访问端口连接培养区域和外部环境。

外部泵产生灌注流提供氧气、营养物质并去除废物，次级入口可注入补充剂。

多种传感器技术可提供实时实验数据，如Zhang等的研究中，使用了集成物理、生化和光学传感器的模块化传感MFB平台。该平台由蠕动泵、培养基储存器、生物电化学传感模块、物理/化学传感模块、流量控制面包板模块、气泡陷阱和类器官培养模块组成。通过该平台，可实时监测微环境参数、可溶性生物标志物和类器官形态。

3.3 对类器官培养的优势

能够精确调节微环境参数，控制氧气、营养物质和其他补充剂的输送，提高类器官培养质量。

确保更均匀的发展、定向分化，减少传统培养技术或其他生物反应器平台导致的不可预测性、异质性和缺乏一致性。

能够模拟生理条件，如生成梯度、应用时空信号分子和诱导或减少机械力，以模拟和研究细胞对特定刺激的反应。

3.4 在类器官培养中的应用

Fu等的研究表明，MFB可用于形成、培养和分析多细胞球体。在他们的实验中，使用刻有U形结构的PDMS微腔室的MFB，通过流体流动和单位重力沉降，成功生成了许多均匀的多细胞球体。

Wang等的研究表明，MFB可用于维持hiPSC衍生的肝脏类器官的长期培养。他们使用配备可灌注微柱阵列的MFB，通过分析肝脏类器官的生长，发现与静态培养相比，灌注培养条件下的类器官细胞存活率更高，且尺寸分布与分化进展呈正相关。

Achberger等的研究表明，MFB可用于培养视网膜类器官。他们构建的Retina - on - a - Chip（RoC），通过在PDMS wafers之间放置多孔聚乙烯对苯二甲酸酯（PET）膜，培养视网膜类器官和视网膜色素上皮（RPE），与传统静态培养相比，形成了更多的外节段结构。

3.5 局限性

制造困难、耗时，材料可能不完全生物相容，可能改变细胞行为、产生有害副产物并减少流体流动，对类器官培养产生不利影响。

设计和制造过程复杂，成本高，需要专业知识和技能，难以放大规模进行大规模实验。

长期实验可能会受到污染，维护困难，难以快速、反复确定培养状态，需要额外的设备或技术，增加了成本。

四、旋转壁容器（RWV）

4.1 原理和特点

RWV源于clinostat，通过旋转圆形或圆柱形容器创建低剪切混合和模拟微重力。

一般有慢转向侧向容器（STLV）和高纵横比容器（HARV）两种类型，同步旋转使液体在容器内进行“固体体”旋转，产生温和的低剪切混合和连续翻滚运动。

STLV和HARV的主要区别在于整体形状和通气源，STLV常用于需要精确控制氧气水平的培养，HARV提供更多氧合，更适合类器官培养。

4.2 在类器官培养中的用途

增强细胞培养：在低剪切环境中显著增强混合，可提高细胞性能，如在人类细胞系中重组蛋白产量增加。

形成球体：通过在RWV中高密度培养细胞使其自聚集形成球体，Botta等的研究中对球体形成进行了实时成像，显示聚集物体的大小随时间增加。

扩增多能干细胞：可在悬浮培养中扩增大量干细胞并维持其多能性，无需昂贵的基质蛋白。例如，Rogers等使用廉价的明胶基微载体在55 mL商业RWV系统中培养人类间充质干细胞，细胞在8天内扩增了16倍，并保持了分化能力和免疫调节潜力。

促进类器官分化：可将类器官分化为特定组织类型，如Wilkinson等使用4 mL HARV型RWV生成肺组织类器官，适用于高通量筛选；DiStefano等将部分新生类器官转移到RWV中培养，与静态培养相比，RWV中的视网膜类器官生长更快、成熟更早，RNA - seq转录组分析表明，RWV中类器官的基因表达模式与体内视网膜更早时间点的模式匹配。

4.3 模拟微重力

RWV最初由NASA开发用于模拟细胞/组织培养中的微重力环境，Lelkes等的研究表明，神经元/神经内分泌PC12细胞在RWV中培养时，与在静态条件下培养相比，多种信号通路和肾上腺素能酶PNMT上调，血管生成增加。RWV中培养的神经内分泌类器官植入小鼠后，血管化程度明显高于静态培养。

4.4 局限性

用户需要具备较高的操作能力，避免在细胞接种和培养基交换过程中引入气泡，如计算模型显示，气泡的存在会导致局部剪切力显著升高，损害培养效果，需要使用特殊设计的“气泡隔离”HARV型RWV来去除气泡，如图7所示。

需要确定合适的旋转速度以维持固体体旋转和类器官的连续自由落体之间的平衡，对于均匀的类器官培养，旋转速度需随类器官大小增加而调整，而对于异质类器官培养，可能难以找到适合所有颗粒的旋转速度。

RWV模拟的微重力环境可能对某些细胞和组织类型产生不利影响，并非所有类器官都适合在RWV中培养，如一些研究表明微重力环境会导致心脏细胞钙处理改变、软骨生成减少以及干扰细胞分化途径等。

五、电刺激生物反应器（ES）

5.1 原理和特点

ES生物反应器是指能够为细胞和类器官提供电刺激的生物反应器，最常见的方法是直接刺激，将电极直接插入培养基中。

一些组织是“电可兴奋”的，可响应或产生电信号，ES生物反应器系统通常包括电极和提供电刺激的系统。

5.2 对类器官的电刺激

5.2.1 促进可兴奋组织类器官的分化和成熟：

Eng等的研究中，使用定制的生物反应器对干细胞衍生的心肌细胞进行电刺激，随着刺激频率的增加，心脏基因表达增加，细胞 - 细胞连接增强，频率适应能力提高。通过对不同刺激频率下的心脏类器官进行免疫染色和qPCR分析，表明电刺激可导致心脏基因表达和细胞连接的改善。

Yoshida等的研究中，使用有机碳电极在聚乙烯醇水凝胶室中对hiPSC衍生的心肌细胞进行电刺激，增强了心脏肌钙蛋白表达和肌节形成。

5.2.2 增强神经类器官的培养：

Ma等的研究中，使用IonOptix C - Pace商业刺激系统对hiPSCs进行电刺激，诱导早期心肌细胞分化，在电刺激后2天即可观察到类器官收缩，而无电刺激则需要7天。

Zhang等的研究中，使用3D交错电极对原代小鼠皮质神经元培养的神经类器官进行电刺激，促进了神经突的生长和突触的形成，拯救了NRG1 - KO神经元的表型。如图9所示，通过对不同基因型的神经类器官进行免疫荧光成像和定量分析，表明电刺激可改善神经类器官的发育和功能。

5.3 商业与定制系统

有多种商业设备可用于细胞的电刺激，如IonOptix的Culture Pacing System（C - Pace）在许多研究中被使用。

一些研究人员更喜欢开发完全定制的ES设置，原因包括能够进一步定制系统，如使用不同的电极材料、培养容器，设计系统可包含商业系统中没有的功能，且许多定制系统成本相对较低。

六、讨论与未来展望

6.1 各生物反应器的优缺点

SBR简单易用，但可能难以进行某些修改；MFB控制精确，但制造和操作复杂，成本高；RWV可调节流体流动并提供微重力环境，但也面临一些挑战；ES主要提供电刺激，缺乏媒体混合或流体流动，但可与其他技术结合。

6.2 缺乏的技术

缺乏组合生物反应器，难以找到为类器官培养设计的提供多种刺激的生物反应器系统，也缺乏为类器官提供机械压缩/张力刺激的生物反应器。

6.3 商业与定制生物反应器的比较

定制生物反应器成本低，设计灵活，但在材料选择和灭菌方面存在挑战；商业生物反应器通常使用特定材料，灭菌方便，但成本较高。

6.4 未来发展方向

将更多先进的基因工程方法纳入类器官培养，如使用基因编码的荧光标记和单细胞RNAseq分析。

未来有望看到生物反应器技术在器官移植、药物发现和个性化医学等领域的更多应用，但需要解决一些技术挑战，如验证新的类器官系统与天然系统的可比性，避免iPSC衍生的类器官中未分化干细胞形成肿瘤或畸胎瘤的风险等。

总之，生物反应器对于类器官的体外培养至关重要，不同类型的生物反应器各有优劣，未来的研究应致力于改进现有技术并开发新的技术，以更好地满足类器官培养的需求。

参考文献：

Licata JP, et al. Bioreactor Technologies for Enhanced Organoid Culture. Int J Mol Sci. 2023 Jul 13;24(14):11427.