前言纳米颗粒（NPs）被定义为具有至少一维尺寸小于100纳米的颗粒，由于其巨大的表面积，它们往往与相同成分的较大颗粒产生不同的反应，使它们可以在新颖应用中得到应用。
银纳米颗粒由于其光学、抗菌、电化学和催化特性而被广泛应用。然而，银纳米颗粒的化学合成通常使用对环境有毒或对生物有害的还原剂，因此人们一直在寻找更环保的生产替代方案。
在自然界中，许多微生物、植物提取物和真菌通过生物途径产生纳米颗粒。其中，银纳米颗粒的合成得到了广泛研究，而这些研究主要关注普遍存在的真菌种类，如木霉属、镰刀菌属和青霉属。
据我们所知，目前尚未对苔藓植物的真菌内生菌株，进行银纳米颗粒合成的评估。
因此，我们的目标是找到一种能在两种不同培养基中，合成金属银纳米颗粒的苔藓。
其中一种培养基促进硝酸盐还原酶的活化，另一种培养基抑制硝酸盐还原酶的活化。
同时，我们将评估所得到的纳米颗粒的形态特征、化学组成和光学性质。
实验和材料1.真菌分离、AgNPs的生长和合成
我们对来自圆锥孢子（类肝苔）的分离物A3（丝核菌属）进行了测定，以确定其将水性银离子转化为银纳米颗粒的能力。
选择该分离株是因为先前的实验显示，它能够耐受基质诱导的水分胁迫，表明它是一种苔藓植物内生菌，并具有无菌菌丝体。
我们使用了阿格诺3+CN和银2所以4+CN培养基，其碳/氮比与琼脂糖相一致，并且使用了其他研究人员报告的相同浓度的银离子。
阿格诺3+CN培养基支持真菌生长，并促进硝酸盐还原酶的表达，该酶与银纳米颗粒的生成有关。
硝酸盐是硝酸盐还原酶的诱导剂，而碳/氮比支持比不含碳培养基更好的生长。银2所以4+CN培养基也支持真菌生长，但氮源（L-谷氨酰胺）抑制了硝酸盐还原酶的产生，因此需要通过其他途径产生银纳米颗粒。
在实验中，我们将活跃生长的真菌菌丝体，培养在含有300ml初始生长培养基的琼脂塞防腐地中。
初始生长培养基包含8克营养肉汤[Difco]、4克酵母提取物[Difco]和10克葡萄糖[L−1蒸馏水]。接着，我们将培养皿放置于摇动培养器中（摇动速度约为25rpm，温度为约23°C），并进行为期14天的培养。
在层流罩下，我们使用高压灭菌的滤纸，将真菌菌落与初始生长培养基进行重量分离。然后，我们使用约20ml高压灭菌水，从真菌菌丝体周围洗涤掉多余的生长培养基。
当我们进行实验时，将活跃生长的真菌菌丝体，放入经过高压灭菌处理的烧瓶中，烧瓶内含有300毫升初始生长培养基。
该培养基包括8克营养肉汤[Difco] + 4克酵母提取物[Difco] + 10克葡萄糖[L−1蒸馏水]。然后，我们将烧瓶放置在摇动培养器中，以约123rpm的速度，在约25°C下培养14天。
在层流罩下，我们使用经高压灭菌处理的滤纸，将真菌菌落与初始生长培养基进行重量分离。接着，我们用约20毫升高压灭菌水，洗涤真菌菌丝体周围的多余生长培养基。
进行连续三次洗涤后，我们使用无菌镊子将约5.0克（湿重）的洗涤分离物转移到4个无菌烧瓶中。
每个烧瓶含有以下培养基之一：AgNO3培养基和银2所以4培养基。AgNO3培养基含有固定的碳/氮比率，以支持真菌生长并上调硝酸盐还原酶。
该培养基的组成为AgNO3+CN：1.0毫摩尔硝酸银+0.83克硝酸钾+0.2克葡萄糖+0.2克葡萄糖，每升蒸馏水。而银2所以4培养基也含有相同的固定碳/氮比率，但通过L-谷氨酰胺诱导硝酸盐还原酶的抑制。
该培养基的组成为Ag2SO4+CN：1.0毫摩尔硝酸银+1.0克L-谷氨酰胺+0.2克葡萄糖+0.2克葡萄糖，每升蒸馏水。
接种的烧瓶将返回摇动培养器，在室温下继续摇动培养96小时。在此期间，我们将测定银纳米颗粒的形成产量和特征。
2.AgNP分离的离心机程序
两种培养物，一种在Ag2SO4+CN培养基中培养，另一种在AgNO3+CN培养基中培养，被用于超声波处理。
我们使用功率为10W的超声细胞破碎仪对菌丝体进行超声波处理，同时另设一个未超声波处理的对照组。
对照试管被放置在Clay-Adams离心机中，以2800rpm的速度离心。离心后，上清液被收集并放置一边（含有银离子的溶液）。
然后，向每个含有菌丝体的对照试管中加入10毫升无菌水，用手强烈摇动30秒，并在Beckman Model J2–21离心机中以15000rpm（30,996 g）的速度离心10分钟。
离心后，上清液被收集在一个单独的干净试管中。
经超声波处理的培养物在Beckman Model J2–21离心机中以15000rpm（30,996g）的速度离心10分钟。离心后，上清液被收集在一个单独的干净试管中（含有银离子的溶液）。
然后，向每个沉淀中加入10毫升无菌水，随后用手强烈摇动30秒以重新悬浮沉淀。含有重新悬浮沉淀的试管再次以相同的设置进行离心。
离心后，上清液被收集在一个单独的干净试管中（经超声波处理的洗涤溶液）。沉淀被重新悬浮在10毫升无菌水中（沉淀溶液），并对所有样品进行测定。
3.分析
图像采用配备了X射线探测器进行能量色散X射线光谱（EDX）的Vega TC SBII扫描电子显微镜进行。
颗粒大小是通过Vega TC软件进行测量的。光学透射是使用Ocean Optics的光谱仪USB2000与氙灯光源进行的。
结果与讨论对于丝核菌属分离物来说，两种培养基都促进了良好的真菌生长，但在含有L-谷氨酰胺的培养基中，真菌生长更为显著（如下图）。
当对含有L-谷氨酰胺的培养基进行硝酸盐还原酶抑制能力评估时，结果表明真菌L-谷氨酰胺上清液管中的硝酸盐浓度与L-谷氨酰胺对照管相当。
而对于含有真菌硝酸盐上清液的管与对照管相比，硝酸盐评估培养基显示出明显的颜色强度减少，从而表明硝酸盐浓度有所降低。
银NP特性这种喜生于苔藓植物的丝核菌属分离物，能够在AgNO3+CN和Ag2SO4+CN培养基中产生银纳米颗粒。
在这两种培养基中，银纳米颗粒位于真菌菌丝体外部，通过扫描电子显微镜图像可见，并且主要集中在菌丝表面附近，同时也有一些银纳米颗粒未附着在菌丝表面上。
在这两种培养基中，培养液的颜色没有明显变化。这与之前一些真菌研究的情况不同，之前的研究中观察到培养液呈现褐色变化，这被归因于胞外银纳米颗粒的形成。
培养液颜色缺乏明显变化可能是由于真菌菌丝体，具有生物吸附金属物质并将其结合到细胞壁成分的能力。
据推测，在AgNO3+CN培养基中发生了胞外酶催化的纳米颗粒形成，就像之前的研究中所报道的那样，随后发生胞外沉淀，并且纳米颗粒与菌丝细胞壁结合。
我们对各种培养液进行的光学分析支持这个最可能的结论，因为在用蒸馏水对洗涤过的真菌菌丝进行激烈摇动后获得的洗涤液中，只检测到了等离子体共振的信号。
下图展示了产生于Ag2SO4+CN培养基中的亚球形至广椭圆形银纳米颗粒，宽度约为25-50纳米，嵌入在一个基质中。
下图展示了产生于AgNO3+CN培养基中的银纳米颗粒的形态。它们具有相似的大小和形状，但看起来有不同的覆盖形式。
在分离物A3未经改变的洗涤溶液中，较大的银颗粒被观察到呈团聚状态，平均大小为50到250纳米。
在Ag2SO4+CN培养基中观察到的这种团聚配置，下图表明它们的形成是由菌丝细胞壁上的成核中心所引发的。
A3（丝核菌属）洗涤液的元素分析元素分析清楚地证明了SEM图像中的亮点是银纳米颗粒，并且没有检测到银在其外部。还经常检测到以下元素：碳（C）、氯（Cl）、氮（N）、氧（O）、磷（P）、钾（K）和硫（S）。
在两种超声洗涤液样品在空气中经过200°C的退火处理3小时后，EDX分析并没有显示出AgNO3+CN洗涤液样品中有氯。
然而，经过相同的退火时间处理后，Ag2SO4+CN洗涤液样品中的有氯的目标NP仍被EDX分析检测到。在所有未改变的样品和洗涤液样品中，当检测到氯和硫时，银总是存在的。
氮、磷和过量的碳也存在于许多含银的纳米颗粒中（见下表）。
从EDX分析中，我们得出结论，使用AgNO生产的银NP是3+CN培养基生产的银NPs，与使用Ag2SO相比具有更少的相关化学物质4+CN 介质。
结论我们已经明确地证明了来自圆锥孢子（类肝苔）的一株苔藓植物内生真菌分离物（A3）能够在支持和抑制硝酸盐还原酶的培养基中，将银离子转化为金属银纳米颗粒。
从两种培养基中得到的亚球形25-50nm银纳米颗粒，纯度足以在415nm处表现出表面等离子共振。
在两种试验培养基中，真菌产生的银纳米颗粒明显地嵌入了一种包覆剂，并且显示出与菌丝表面的附着。
我们观察到银纳米颗粒在不同的生长培养基中与不同的化学物质相关。声波处理和离心分离步骤改变了UV-vis光谱吸收带，表明声波处理可以破坏较大的纳米颗粒团聚体。
数据还表明，菌丝核化位点可能参与了在Ag2SO4+CN培养基中一些银纳米颗粒的形成，而在AgNO3+CN培养基中，银纳米颗粒的形成是通过细胞外酶的启动和沉淀，随后是菌丝生物吸附。
经过上述实验证明，我们成功证明了金属银纳米颗粒的生物合成。
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