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胰岛β细胞移植为异位胰岛移植治疗1型糖尿病（T1DM）提供一种替代方法。然而，在胰岛移植中使用全身免疫抑制药物对身体构成重大风险。为了解决这个问题，大连理工大学宋克东、中国科学院过程工程研究所聂毅等构建了一个负载胰岛β细胞的封装复合支架。利用3D打印技术制备的封装结构将猪胰腺脱细胞细胞外基质（dECM）结合到核心支架上。改进的脱细胞化方法成功保留dECM水凝胶中大量的蛋白质（如I型胶原和层状蛋白）结构和糖胺聚糖，同时有效地去除大部分DNA。dECM的加入增强支架的物理和化学性能，包括孔隙率和拉应力。在生物活性研究中，dECM显示出Ki67、PDX1和NKX6.1等转录因子的增殖、分化和表达增强，改善MIN-6胰腺细胞胰岛素分泌功能。在21天的葡萄糖刺激胰岛素分泌实验中，封装结构的最大胰岛素分泌量达到1.96±0.08mIUml−1，比对照组增加44%。此外，传统的胶囊支架可以平均天然生物材料与巨噬细胞的相容性，以减轻免疫排斥反应。将姜黄素加入胶囊支架显著降低T1DM小鼠中RAW264.7巨噬细胞和T细胞分泌的促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ）的分泌。这种方法可以保护胰岛β细胞免受炎症因子介导的免疫细胞浸润，并预防胰岛炎。总的来说，本研究中开发的封装支架有望作为临床治疗T1DM的天然平台。
相关研究内容以“A capsule-based scaffold incorporating decellularized extracellular matrix and curcumin for islet beta cell therapy in type 1 diabetes mellitus”为题于2024年9月19日发表在《Biofabrication》。
图1 胰岛β细胞包封支架的制备与功能
本研究使用3D打印技术制备一种双层混合封装胰岛β细胞支架。该生物墨水由明胶和海藻酸盐组成，将猪胰腺脱细胞基质整合到核心支架中，以增强胰岛细胞的增殖和粘附（图1）。
图2 猪胰腺的组织化学染色
H&E染色通常用于评估组织学表现，在自然组织中，细胞质呈红色，细胞核呈蓝色。图2A显示，胰腺脱细胞处理成功去除大量dsDNA。Masson’s染色用于检测组织中胶原纤维和肌肉纤维的存在。脱细胞过程从胰腺组织中去除大部分肌动蛋白，但保留大量胶原蛋白（图2B）。阿利新蓝染色中细胞核显示红色，GAGs显示蓝色。图2C显示，胰腺脱细胞后仍保留一些GAGs。此外，免疫组化染色显示脱细胞组织中存在I型胶原和层粘连蛋白，影响胰岛β细胞的增殖和分化（图2D、E）。图2F中的DAPI染色证实脱细胞后大多数dsDNA被去除。脱细胞化的定量评估结果如图2G-I所示。
图3 不同dECM浓度下Gel/Alg/dECM生物油墨的流变学试验
通过在油墨中加入不同数量（0%、0.5%、1%、1.5% w/v）的脱细胞基体进行流变学分析。，油墨的临界溶胶-凝胶温度在20℃左右，随着温度降低，存储模量显著增加（图3A），表明生物油墨具有良好的温度敏感性。添加含有胶原蛋白的脱细胞基质，可提高油墨的温度敏感性（图3A2）。图3B显示生物墨水在100rad s−1频率下的粘弹性特性。1%dECM组的存储模量最高，而0.5% dECM组的损耗模量最低。图3C分别描述生物油墨的稳态粘度和触变性测试，反映它们经历剪切变薄和可逆结构变化的能力。
图4 海藻酸盐-姜黄素微粒的制备
为增强复合支架的免疫保护作用，本研究采用pH驱动的方法制备姜黄素。姜黄素单体具有酚类羟基结构，具有疏水性。在海藻酸盐中封装姜黄素显著提高其水溶性（图4A）。通过扫描电镜观察药物形态（图4B-D）。游离姜黄素单体被拉长，而海藻酸盐包封后形成海藻酸盐-姜黄素微球（Alg-Cur）。测定姜黄素和海藻酸盐的不同比例，探讨其封装效率（EE）和载荷能力（LC）。结果表明，随着姜黄素浓度的增加，EE含量降低（图4E）。最高药物LC为0.1mg ml−1Cur：1mg ml−1Alg，加载率为5.31%±0.48%（图4F）。后续药物制备实验采用该比例。Alg-Cur微球直径为956.93±23.88nm，zeta电位为−18.77±0.35 mV（图4G、H）。采用FTIR分析检测Alg-Cur，结果如图4I所示。图4J、K描述负载Alg-Cur支架在降解溶液中的释放，以模拟人类的内部环境。负载姜黄素的支架降解缓慢，大部分颗粒仍结合在明胶的交联网络中。随着明胶降解，逐渐被释放，允许Alg-Cur在支架内持续释放。
图5 不同dECM浓度（0%、0.5%、1%、1.5% W/V）支架的表征
图6 封装支架的宏、微观形态
dECM浓度增加导致孔隙率的相应增加，显著增加支架内的比表面积。这种增加促进更广泛的细胞增殖和迁移。图5C、D描述了支架的膨胀率和吸水率结果。随着支架孔隙率增加，支架的吸水率和溶胀性能逐渐增强。图5E、F显示在不同dECM浓度的支架上进行的拉伸性能试验的结果。dECM的掺入增强支架的应力和应变。然而，随着dECM加入，孔隙率增加，支架的机械性能下降。总体而言，0.5% dECM浓度的力学性能最好。
核心支架使用浓度为0.5% dECM的油墨打印，并组装成一个胶囊支架。胶囊尺寸如图6A所示。由于脱细胞基质的加入，导致肿胀增加，核心支架尺寸增加，从而导致打印尺寸减小。图6B显示了胶囊的扫描电镜图像。B1和B2清楚显示两个支架的嵌套结构，图B3为添加dECM的核心支架的放大横截面，B4为添加Cur的胶囊支架的放大横截面。脱细胞基质的加入增加支架孔隙率。
图7 不同支架的细胞相容性试验
图8 对在2D细胞培养板（对照组）和3D支架（dECM−和dECM+组）上培养的MINM-6细胞进行免疫印迹检测
图9 负载Alg-Cur微球支架的体外抗炎试验
图10 不同支架上MIN-6细胞的细胞相容性和葡萄糖刺激的胰岛素分泌
图11 脾细胞在2D细胞培养板上培养（对照组），并在第2天与装载MIN-6细胞的3D支架（dECM组和胶囊组）共培养的检测评价
如图7所示，将MIN-6细胞接种到dECM组的支架上进行细胞相容性测试。与对照组相比，dECM支架的孔隙率更高。dECM含有大量I型胶原，导致细胞粘附率高于对照组（图7D）。对照组在第7天的CCK测定中的吸光度低于dECM组（图7C），与活/死染色的结果一致（图7A、B）。
通过免疫荧光和免疫印迹测试研究2D细胞培养板和3D支架中MIN-6细胞的增殖和分化行为（图8），细胞增殖转录因子Ki67在dECM支架组培养的细胞中显著表达（图8A、E）。与对照组（2D细胞培养）相比，没有dECM的空白支架组（dECM−）和dECM支架组（dECM+）显示出更高的胰岛β细胞分化因子PDX1和NKX6.1水平（图8C、D、F）。值得注意的是，对照组的细胞内胰岛素含量高于3D支架组（图8B），dECM+组与对照组相似。
图9显示了在负载不同浓度的Alg-Cur胶囊支架上培养RAW264.7细胞。与空白支架对照组相比，LPS诱导的炎症导致RAW264.7细胞快速极化为M1巨噬细胞（图9A）。然而，随着Alg-Cur浓度增加，细胞逐渐恢复到类似于空白支架对照组的椭圆形。用于移植的组织工程支架是一种异物，即使没有LPS刺激，也能诱导RAW264.7细胞中促炎因子分泌，而LPS刺激后促炎因子的释放更为明显（图9B-D）。细胞周期分析结果表明，Alg-Cur微球支架可以抑制LPS诱导的细胞周期阻滞在Raw264.7细胞极化后的G2/M期（图9E、F）。
胶原蛋白和GAG可以促进MIN-6细胞的增殖和粘附，重塑细胞间的ECM环境，加速其分化，促进假胰岛的自组装。这种聚集现象在培养的第14天尤为明显（图10A）。E-钙粘蛋白（E-cad）是一种细胞粘附分子，在MIN6细胞之间完全表达，表明细胞-细胞连接促进了MIN-6细胞聚集物的形成（图10C）。图10B显示，低糖21天，dECM组在低糖刺激下分泌1.81±0.09mIU ml−1，与胶囊组观察到的分泌相似（1.87±0.07mIU ml−1）。最大胰岛素分泌量达到1.96±0.08mIU ml−1，与对照组相比增加44%（1.36±0.12mIU ml−1）。
用STZ诱导BALB/c小鼠1型糖尿病后，提取脾脏细胞，分别与负载MIN-6细胞的dECM组和胶囊组体外共培养。其中，20%的脾脏细胞由CD3+ T细胞组成（图11A），13%的脾脏细胞为螺旋T细胞（CD4+，CD8−，图11B）。经过两天共培养，dECM组的IFN-γ显著增加，而胶囊组下降到与对照组相似的水平（图11C）。此外，IL-2分泌水平保持在如图11D所示的高水平。免疫荧光染色结果显示，对照组IFN-γ分泌很少，但dECM组负载MIN-6细胞引起T细胞诱导的特异性免疫攻击，而负载姜黄素胶囊组避免这一过程（图11E）。
全文小结
综上所述，本研究使用3D打印技术开发了一种胶囊型复合支架，将姜黄素包埋在藻酸盐中，通过pH驱动的方法加入支架，以增强免疫抑制效果。RAW264.7细胞具有体外抗炎能力，通过LPS刺激转化为M1巨噬细胞。研究发现，姜黄素显著降低炎症细胞因子释放。此外，通过分离STZ诱导的小鼠脾淋巴细胞，建立T1DM体外免疫模型。姜黄素可显著调节T辅助细胞中IFN-γ细胞因子的分泌，从而发挥特异性的免疫抑制作用。将改良的脱细胞化方法应用于猪胰腺，有效去除细胞外基质，同时保留细胞外基质的结构和组成。该核心支架来源于猪胰腺脱细胞基质，不仅改善力学性能和孔隙结构，还促进细胞粘附和细胞外基质环境重建。对于MIN-6胰岛β细胞，脱细胞基质促进其分化和自组装成细胞簇，增强其胰岛素分泌能力。总之，利用胰腺脱细胞基质开发的组织工程支架可以增强胰岛β细胞功能，并具有恢复1型糖尿病患者血糖水平调节的潜力。此外，设计的胶囊封装结构和姜黄素的使用有助于提高人工胰腺样支架的临床治疗潜力。
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