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利用吸光性光敏剂（PS）和组织中的氧气，在光照射下产生活性氧（ROS），光动力疗法（PDT）被认为是一种临床批准的非侵入性治疗局部肿瘤的方法。迄今为止，PDT已广泛应用于治疗浅表性膀胱癌、一些非黑色素皮肤癌和癌前角化病变，因为其副作用少、治愈率高的优点。然而，PDT在低氧实体肿瘤中的功效不足仍然是一个巨大的挑战，需要在深部低氧肿瘤中高效产生ROS。光动力疗法（PDT）已被批准用于临床治疗。然而，对于深部低氧肿瘤治疗而言，PDT的功效不足仍然是一个巨大的挑战。
来自中国科学院化学研究所的甄明明、王春儒和白春礼团队设计了一种基于富勒烯（C70）和缺氧激活化学前药替拉巴胺（TPZ）的低氧感应纳米治疗系统（FTCD-SRGD），用于深部低氧肿瘤的多模式治疗。为了增强在肿瘤中的积累并实现特异性药物释放，FTCD-SRGD经过环状(Arg-Gly-Asp-d-Phe-Lys)（cRGDfK）肽和二硫键的修饰。通过C70消耗氧气生成活性氧（ROS）来加剧低氧微环境，激活TPZ产生有毒自由基物质以消灭深部肿瘤，从而实现了C70介导的PDT和低氧增强化疗的协同治疗。此外，由于此低氧感应系统诱导的免疫原性细胞死亡（ICD）能够激活抗癌细胞毒性T淋巴细胞，使肿瘤对免疫疗法更加敏感，因此FTCD-SRGD与免疫检查点抑制剂（抗PD-L1）一起能够通过促进效应T细胞在肿瘤中的浸润来完全抑制深部低氧肿瘤。总的来说，这是首次开发出基于富勒烯的低氧感应光敏剂的多模式治疗系统，用于治疗深部肿瘤。这种强大的多模式纳米治疗系统结合低氧增强PDT和免疫疗法来消灭深部低氧肿瘤，为解决肿瘤治疗的当前瓶颈提供了一个范例。相关工作以题为“Developing Hypoxia-Sensitive System via Designing Tumor-targeted Fullerene-Based Photosensitizer for Multimodal Therapy of Deep Tumor”的文章发表在2024年03月07日的国际顶级期刊《Advanced Materials》。
1. 创新型研究内容
本研究提出了一种策略，通过设计基于富勒烯的低氧感应光敏剂系统FTCD-SRGD，以优秀的溶瘤效果进行多模式癌症治疗。具体而言，采用功能合成的方式，利用富勒烯（C70）和低氧活化的抗癌前药替拉巴胺（TPZ），获得了低氧感应光敏剂系统。值得注意的是，为了使光敏剂系统在肿瘤中高度积累，本研究将FTCD-SRGD修饰为cRGDfK肽和二硫键（DTSSP），使其能够靶向过表达整合素的癌细胞，并在肿瘤微环境中实现谷胱甘肽响应性释放。在光照照射下，C70消耗氧气产生ROS以消灭肿瘤。随着低氧加剧，TPZ被激活产生有毒自由基物质进一步消灭肿瘤，与深部低氧肿瘤中的光动力疗法协同治疗。更重要的是，PD-L1抗体，一种已在临床中批准的免疫检查点抑制剂，与FTCD-SRGD相结合，通过光动力疗法诱导的免疫原性细胞死亡（ICD）刺激免疫反应，对消灭肿瘤非常有效。综上所述，基于富勒烯的纳米治疗系统增强了低氧活化的光动力疗法和免疫疗法对深部低氧肿瘤的抑制作用。
图1 FTCD-SRGD 的表征
本研究通过Prato反应，得到了C70-FA。经过纯化后，利用质谱（MALDI-TOF-MS）和1H核磁共振（NMR）谱图确认成功合成了C70-FA。可以观察到C70-FA的强信号（m/z 1044，图1A）和特征的质子信号。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）显示，3020-3000 cm-1、1720 cm-1和1100 cm-1处的特征峰对应于2-(3-甲酰基苯基)乙酸的C-H、C=O和C-O的伸缩振动带。1540-1500 cm-1处的峰对应于C=C的振动带，归因于C70的碳笼（图1B）。然后，在CH2Cl2中发生了纯化后的C70-FA和OH-PEG-Mal之间的酯化反应，并且产物（C70-FPEG-Mal）通过超纯水透析以消除过量的OH-PEG-Mal。在1H NMR谱图中观察到C70-FPEG-Mal中PEG的质子峰。图1B中的FT-IR显示，1160 cm-1、1500 cm-1和1740 cm-1处的特征峰对应于C-O-C、C=C和C=O的伸缩振动，确认了C70-FPEG-Mal的存在。接下来，C70-FPEG-Mal和β-CD-NH2（含有主要氨基的β-环糊精，Mn = 1.13 kDa）的主客体相互作用，以及Mal和cRGDfK-SH（Mn = 0.69 kDa）之间的点击化学反应，获得了FPEG-CD-RGD。热重分析、质谱、FT-IR和紫外-可见（UV-vis）光谱用于验证FPEG-CD-RGD的成功合成。纯化后，热重分析证实了β-CD-NH2的存在，与质谱结果一致。大部分的FPEG-CD-RGD（Mn = 7.1 kDa）通过主客体相互作用具有三个β-CD-NH2，少量的FPEG-CD-RGD（Mn = 9.3 kDa）具有五个β-CD-NH2。同时，位于3300 cm-1、2930 cm-1和1160 cm-1处的峰对应于β-CD-NH2的O-H、C-H和C-O的伸缩振动（图1B）。UV-vis光谱中280 nm处的蛋白质特征吸收峰证实了含有cRGDfK-SH基团（图1C）。PS系统的宽UV吸收为光动力疗法奠定了基础。由于两亲性，FPEG-CDRGD能够自组装成具有疏水核和亲水壳的纳米粒子，可以封装疏水性抗癌前药TPZ，其药物装载效率为13.03%。
图2 FTCD-SRGD的体外细胞实验
本研究使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）试验来探索FTCD-SRGD的细胞毒性。结果显示，即使在高浓度（高达200 μg/mL）下，FTCD-SRGD对人类正常肝细胞（L-02）和小鼠巨噬细胞白血病（RAW264.7）细胞的细胞毒性极低，表明其具有良好的生物相容性（图2A）。这是由于TPZ和C70在正常条件下不具有毒性。此外，还研究了FTCD-SRGD在缺氧条件下的光细胞毒性（图2B）。在21%的氧气水平（正常氧气水平）下，分别使用腺癌人肺泡基底上皮细胞（A549）和乳腺癌细胞（4T1）来探索在黑暗中或可见光照射下（MVL-210，Mejiro Genossen，日本）的细胞毒性效应。如图2C和2D所示，当暴露于光照射时，细胞存活率降低，这归因于C70具有良好的光敏剂特性。在上述结果的鼓舞下，评估了在2%氧气水平（缺氧条件）下的细胞存活率。与正常氧气水平的结果不同，即使在黑暗中，与FTCD-SRGD培养的细胞的存活率也要低得多，并且与相同条件下的正常氧气水平组相比，细胞存活率降低了27%。同时，在光照射下，FTCD-SRGD表现出惊人的细胞毒性，与对照组相比，细胞存活率下降了44%（图2E）。结果表明，缺氧引发了TPZ的活化，TPZ和C70能够同时发挥作用。同时，结果证实了FTCD-SRGD具有出色的缺氧光细胞毒性。
图3 FTCD-SRGD的体内分布
受到FTCD-SRGD在体外的缺氧光细胞毒性的鼓舞，本研究进一步探索了FTCD-SRGD在体内的抗肿瘤效能。在进行肿瘤治疗之前，首先检查了小鼠体内尤其是靶向肿瘤的生物分布情况。将标记有Cy5.5分子的FTCD-SRGD静脉注射到携带肿瘤的小鼠体内，作为对照，使用游离的Cy5.5。在不同的时间点对注射的小鼠进行体内成像。观察到FTCD-SRGD在肝脏和肾脏中的积累，特别是在肿瘤中，这表明FTCD-SRGD具有很好的肿瘤靶向性。值得注意的是，与非靶向的游离Cy5.5相比，肿瘤靶向的FTCD-SRGD在3小时、8小时和24小时时显示出更高的信号，这归因于FTCD-SRGD中的cRGDfK具有出色的整合素靶向能力。此外，第7天只观察到微弱的信号，说明FTCD-SRGD能够逐渐被清除和排出体外（图3A）。为了进一步精确检查，收集小鼠的主要器官和组织，包括心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和肿瘤，进行体外成像，分别在注射后的3小时、8小时、24小时、48小时和7天进行。结果清楚地显示FTCD-SRGD主要分布在肝脏、肾脏、脾脏和肺部，与体内结果一致。值得注意的是，FTCD-SRGD能够迅速到达肿瘤，显示出良好的靶向性。第7天，在除肾脏之外的主要器官中几乎没有检测到信号，这证实了FTCD-SRGD的高效代谢（图3B）。此外，本研究对接受基于FTCD-SRGD的光动力疗法的携带肿瘤小鼠进行了肝功能和肾功能的生化指标检测，结果显示几乎没有差异，表明其不存在严重的全身毒性（图3C-F）。
图4 FTCD-SRGD的体内抗肿瘤功效
此外，本研究使用4T1肿瘤模型进一步探究了FTCD-SRGD的治疗效果。将48只雌性BALB/c小鼠植入右侧皮下4T1肿瘤，随机分为八组。不同的治疗剂包括生理盐水、不含TPZ的FCD-SRGD、TPZ以及FTCD-SRGD通过静脉注射给予（图4A）。注射后3小时，小鼠接受白光照射（0.1 W·cm−2）20分钟。结果显示，接受生理盐水和带有或不带有光照的FCD-SRGD治疗的组观察到迅速的肿瘤生长，表明肿瘤抑制效果较弱。接受TPZ治疗的肿瘤有中等程度的抑制，无论是否有光照。FTCDSRGD组有效延缓了肿瘤生长，肿瘤抑制率约为63%。而带有光照的FTCD-SRGD导致了最显著的肿瘤抑制效果，肿瘤抑制率约为88%（图4B）。在第16天，所有肿瘤被切除并称重，这确定了FTCD-SRGD与光照组的抗肿瘤功效（图4C）。结果证实，与单独的光动力疗法或化疗相比，光动力疗法和缺氧激活化疗的优越联合效果表现出最强的抗肿瘤效果。同时，使用苏木精和伊红（H&E）染色对肿瘤组织进行成像。带有光照的FTCD-SRGD组显然出现了严重的核分离和坏死，而对照组则注意到较轻的损伤（图4D）。相反，心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏等其他器官在所有组中均未显示出明显损伤（图4E），这意味着FTCD-SRGD治疗后毒性可忽略。
图5 FTCD-SRGD联合抗PD-L1抗体进行多模式癌症治疗
本研究通过免疫荧光染色探究了T细胞。免疫染色证实了在接受FTCD-SRGD与光照治疗的肿瘤中T细胞的高度阳性表达。受到FTCD-SRGD光触发的细胞免疫的鼓舞，本研究进一步评估了FTCD-SRGD是否能与经FDA批准用于临床的PD-L1阻断治疗产生协同效应。在光动力疗法触发后，雌性BALB/c小鼠每隔三天接受一次抗PD-L1抗体。如图5A-C所示，经FTCD-SRGD和抗PD-L1抗体治疗后，肿瘤完全被抑制，肿瘤抑制率约为93%。结果证实，缺氧激活的光动力疗法和免疫检查点抑制剂的协同效应与其他组相比表现出最强的抗肿瘤效果。为了进一步揭示潜在的免疫机制，本研究通过免疫荧光染色实验研究了抗肿瘤免疫。具体而言，在联合缺氧激活的光动力疗法和免疫治疗组的肿瘤中，CD4+ T细胞（图5D）和CD8+ T细胞（图5E）的阳性表达明显增加，远高于对照组。综上所述，结果表明，FTCD-SRGD介导的缺氧激活光动力疗法与检查点阻断治疗通过效应T细胞的浸润增强了抗肿瘤免疫疗法。
2. 总结与展望
总之，本研究通过功能合成成功构建了一个由富勒烯和TPZ（FTCD-SRGD）组成的低氧感应纳米治疗系统，具有出色的ROS产生能力。同时，引入了针对过表达整合素的肿瘤细胞的环状RGDfK肽和NHS-SSNHS，赋予FTCD-SRGD肿瘤靶向能力和氧化还原敏感性。这些设计确保了光敏剂系统在肿瘤中的高富集，并且在肿瘤微环境中对谷胱甘肽的响应性释放。在体外实验证明，FTCD-SRGD具有出色的光细胞毒性和ROS产生能力。在体内实验中，根据小鼠体内分布成像结果显示FTCD-SRGD能够高度富集在肿瘤中。在光照照射下，C70消耗氧气产生ROS以消灭肿瘤，加剧了肿瘤的低氧状况。与此同时，低氧敏感的TPZ被激活产生ROS。本研究证明了FTCD-SRGD显著抑制了肿瘤的生长，实现了C70介导的光动力疗法和低氧增强化疗的协同治疗。更重要的是，FTCD-SRGD与抗PD-L1抗体相结合，通过光动力疗法引发的抗肿瘤免疫反应和效应T细胞的肿瘤浸润，完全抑制了深部低氧肿瘤。这是首次设计出基于富勒烯的低氧感应光敏剂系统用于光触发的癌症免疫治疗。本研究的低氧感应光敏剂系统整合了低氧增强的光动力疗法和肿瘤免疫疗法，协同抗击深部低氧肿瘤，打破了癌症治疗的现有限制。
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