大家好，今天我们来阅读这篇Biofabrication methods for reconstructing extracellular matrix mimetics发表于《Bioactive Materials》上的文章。细胞外基质在人体中起着至关重要的作用，它不仅为细胞提供支撑，还调节着细胞的各种行为。然而，传统的研究方法在模拟细胞外基质的复杂性方面存在局限。近年来，科学家们发展了多种生物制造方法来重建细胞外基质模拟物，这些方法为组织工程和再生医学带来了新的机遇。接下来，我们将深入了解这些方法及其应用。

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一、引言

细胞与外部环境的相互作用决定其行为，而细胞外基质（ECM）在其中起着关键作用。传统的二维细胞培养模型在模拟体内细胞相互作用方面存在局限性，动物模型则受到测试对象、可行性和伦理等问题的制约。因此，组织工程和器官芯片技术致力于发展材料和结构来模拟ECM，以构建更精确的体外3D组织模型。本综述系统地介绍了ECM及相关的生物制造策略，包括软光刻、静电纺丝和生物打印等，并讨论了其在不同器官模型中的应用。

二、细胞外基质及其功能

（一）组成与结构

ECM是由细胞分泌的存在于动物组织中的非细胞复杂聚合物网络，主要成分包括胶原蛋白、非胶原蛋白糖蛋白、蛋白聚糖和糖胺聚糖。基于结构和化学复杂性，ECM可分为纤维架构和水合间质凝胶两个阶段。

（二）功能

ECM重塑和储存功能

ECM通过Lysyl Oxidases（LOX）的分子间交联进行重塑，其成分如胶原蛋白和其他ECM元素是ADAMs、MMPs以及蛋白酶的底物。MMPs的活性由组织抑制剂（TIMPs）和其他抑制剂调节，失衡可能导致组织纤维化和疾病。ECM还受生物刺激和物理刺激的影响，如转化生长因子-β（TGF-β）可增强ECM生产和上调ECM相关基因。此外，ECM通常作为细胞因子和生长因子的储存库，参与配体成熟过程，例如TGF-β以潜伏形式分泌并储存在ECM中，直到被MMP依赖的蛋白水解作用激活。

ECM与细胞行为和细胞迁移的关系

ECM的生化性质允许细胞通过各种信号转导途径感知和与细胞外环境相互作用，其物理性质为细胞迁移提供了物理线索，包括基质的刚性、密度、孔隙率、不溶性和地形等。例如，间充质干细胞在软基质上倾向于神经源性路径，而在硬基质上则倾向于成骨路径。

三、化学定义的ECM和合成ECM类似物

（一）天然聚合物

天然聚合物也称为生物衍生材料，可通过物理或化学方法提取。一些天然聚合物如明胶、海藻酸盐、纤维蛋白原和透明质酸等是水溶性的，可在细胞友好的无机溶剂中形成溶液或水凝胶，用于3D打印。然而，大多数天然聚合物需要通过点击化学进行功能化，如Thiol-Michael和Diels-Alder加成反应，以创建结构符合的ECM结构。只有少数天然聚合物能满足组织/器官支架生物打印的所有基本要求，在生物打印过程中，它们在细胞和生物分子的活动、组织生成的调节以及生物人工器官的形成等方面发挥着重要作用。

（二）合成聚合物

合成聚合物在生物制造中也被广泛使用，包括聚乙二醇（PEG）、聚己内酯（PCL）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚（L-乳酸）（PLA）和聚（乳酸-乙醇酸）（PLGA）等。它们可以被调整以符合目标组织和器官的特定降解和机械性能要求。虽然一些限制（如使用有毒溶剂、熔点高于体温、难以封装细胞）可能阻碍其转化应用，但合成聚合物仍被开发为生物替代品，以解决使用天然生物聚合物在潜在治疗应用中的一些缺点，例如质量控制和单一细胞群体内的异质性问题，以及不同供应商或批次来源的可变性问题。

例如，为了改善细胞与合成聚合物的相互作用，通常需要对其进行广泛的功能化，如连接粘附肽或蛋白质片段，如精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸（RGD）（纤连蛋白域模拟）肽和Ile-Lys-Val-Ala-Val（IKVAV）（层粘连蛋白域模拟）肽，或与生物衍生的生长因子结合。此外，合成聚合物通常缺乏细胞识别位点和其他生物线索，而这些在天然ECM中对于促进细胞增殖和分化是至关重要的。

（三）脱细胞ECM

脱细胞ECM（dECM）是最接近天然ECM组成的复制品，它来源于天然组织，经过处理去除与细胞相关的物质，同时最大限度地保留不溶性ECM成分。由于ECM的主要不溶性成分，如胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白，在多个物种中基本保守，因此由易于获得的异种ECM来源制备的dECM支架可能为维持人类细胞功能提供跨物种兼容的生物信号。

例如，研究发现脱细胞干细胞基质（DSCM）在干细胞微环境中可能提供一种扩增系统，用于生产大量高质量的细胞用于软骨组织工程和再生。然而，用于体外培养模型的dECM材料通常被简化为涂层、水凝胶或低dECM含量的纤维垫形式，难以定制其生物化学、拓扑结构和超微结构，这限制了其在制造更复杂的体外组织模型中的应用。

四、生物制造方法来重建ECM特征和架构

（一）软光刻微流控

软光刻是一种基于模板的微制造技术，常用材料为聚二甲基硅氧烷（PDMS），它可以与复杂几何形状的基板进行可逆的共形接触，具有高再现性和高横向分辨率。通过软光刻技术，可以制造出具有不同拓扑特征（如凹槽、坑或柱）的微结构，为模拟三维体内环境提供了一种途径。

例如，利用微流体设备可以培养细胞并复制组织中的动态微环境，已开发出多种器官芯片模型，如肺芯片、心脏芯片、肝脏芯片、肠道芯片、血管芯片和脑瘤芯片等，这些模型在生理功能重建、药物发现、药理学研究、疾病建模等方面具有重要应用。

然而，软光刻技术存在基质多样性不足的问题，微流体基板与ECM基质在物理和化学性质上存在差异，封装纤维基质的制造过程复杂，目前仅能模拟器官的部分生理功能或解剖结构。

（二）静电纺丝

静电纺丝通过库仑力从外部电场中提取纤维，可模拟ECM的纤维结构。在过去二十年中，ECM模拟静电纺丝技术不断发展，已应用于多个器官的组织工程，如骨、皮肤、血管移植物、癌症模型和肌腱/韧带等。

例如，静电纺丝纤维可以模拟ECM纤维的拓扑结构，直接影响细胞的形状和焦点粘附的排列。通过低电压静电纺丝可以将ECM结构简化为典型的纤维模式，并进行细胞迁移实验。此外，静电纺丝纤维的孔隙率和形态结构可调节，传统的远场电纺网孔较小，但可用于药物递送和复制天然ECM中的膜结构，而通过改进的静电纺丝技术可以制造出具有大孔隙的纤维结构，如用于构建肾小球模型的致密纤维膜，以及能够支持细胞生长的熔体电纺结构和用于引导细胞聚集的悬浮纤维结构。

然而，目前缺乏能有效图案化厚度大于几毫米的电纺结构的方法，这限制了其在构建厚人工组织中的应用。

（三）3D生物打印

3D生物打印旨在克服传统2D平台的局限性，构建具有精确几何形状和组成的复杂功能性组织支架。常用的3D生物打印方法包括挤压、喷墨、激光辅助和立体光刻等，这些方法在材料耐受性、打印速度、分辨率、经济成本效益和细胞加载密度等方面具有不同的权衡。

例如，通过嵌入式生物打印技术可以制造出具有复杂血管网络的组织模型，如使用各种材料和支持浴来创建血管通道。此外，还可以使用光固化生物墨水（如GelMA、PEGDA等）和新型生物相容性光吸收剂来构建高精度的嵌入式打印血管网络，用于制造功能性白蛋白生产的肝脏模型。

然而，3D生物打印的器官模型仍处于小规模应用阶段，存在生产精度低、模拟特性有限和长期细胞存活及功能等挑战。

（四）自组装

自组装通过非共价相互作用（如范德华力、氢键、疏水作用和静电作用）自动聚集单个小分子形成明确且可重复的层次结构。在组织工程和再生医学中，自组装具有前所未有的可编程性和与细胞高选择性相互作用的优势，可用于开发功能性纳米材料，如使用肽、蛋白质、DNA和聚合物等。

例如，通过酶促修饰、酶触发的自组装、使用改性芳香二肽构建刚性自组装水凝胶以及肽-两亲分子自组装形成纳米纤维用于矿化骨组织等方式，展示了自组装在生物医学应用中的潜力。

然而，自组装面临着立即自组装成强大结构的能力、高成本和可扩展性限制等挑战，未来需要通过新兴的自组装平台和改进的打印方法与生物制造更好地融合。

五、近期应用：用于不同器官培养模型的类ECM基质的生物制造

（一）大脑

大脑ECM主要包括糖胺聚糖、蛋白聚糖、糖蛋白和纤维蛋白等，弹性模量低，其特定结构包括神经元周围网络（PNNs）、基底膜（BM）和间质基质（ISM）。大脑ECM在神经系统中起重要作用，如保证细胞 - 细胞和细胞 - 基质通信、调节神经元和神经胶质的增殖、迁移和突触整合等。

例如，通过修改基板的地形（如凹槽、脊、细丝、纤维和复合排列等设计）或材料组成（如天然聚合物胶原、明胶、透明质酸、琼脂糖、海藻酸盐、纤维蛋白和壳聚糖，以及合成材料聚己内酯、聚-L -乳酸、聚-D，L-乳酸-共-乙醇酸和导电聚合物如聚吡咯（PPy））来模拟大脑ECM的各向异性。

此外，设计新的导电聚合物（如PEDOT和PSS的混合物或PEDOT:PSS与GelMA的混合物）用于大脑的体外或体内应用，可调节神经干细胞的发育并改善其对缺血 - 再灌注损伤组织的抗炎作用。

生物打印方法有助于制造人工大脑ECM和神经组织，如设计肽修饰的聚合物RGD-GG可鼓励细胞增殖和神经网络形成，并构建多层结构以模拟体内大脑皮质层。

（二）血脑屏障（BBB）

BBB是保护神经组织免受有毒物质侵害的选择性屏障，模拟BBB的ECM挑战在于制造极薄的2D层而非3D结构且具有极低的渗透性。常用策略包括使用多孔膜、静电纺丝基板和超薄膜等，还需考虑渗透性和跨上皮/内皮电阻（TEER）测量等特征。

例如，使用胶原 - 基质胶构建BBB-on-a-chip模型，通过降低ECM样层的厚度来模拟BBB的特性，同时使用水凝胶提供准确的刚度和粘弹性。然而，当前生物制造方法难以实现超薄层的制造，且对糖萼层的模拟常被忽视，尽管使用透明质酸（HA）模拟糖萼是一种简单的解决方案。

导电聚合物有望改善屏障评估并为神经元和胶质细胞提供更好的机械和电气环境，以创建更全面的神经血管和中枢神经系统模型。

（三）肝脏

肝ECM仅占肝脏体积的10%，主要分布在内皮细胞和上皮细胞之间，包括纤连蛋白和少量胶原蛋白等。生物制造的聚合物用于创建3D肝脏结构和细胞 - 细胞相互作用，肝脏分区对维持和引导肝细胞分化至关重要。

例如，使用PDMS微流体技术尝试体外重现肝脏分区，但未能确保长期功能稳定性和连续灌注。而结合脱细胞肝脏-ECM宿主原代新生大鼠肝细胞可模拟肝脏分区，实现超过45天的长期功能稳定性。

在生物打印方面，通过将HepG2和HUVEC封装在I型胶原蛋白和明胶水凝胶中，使用一步挤压式生物打印方法构建肝脏芯片模型，可模拟动态条件并实现3D ECM样组织结构。

（四）心脏

心血管ECM负责器官稳态和机械支持，包括基底膜和间质基质。合成聚合物如PEG常与脱细胞ECM混合创造更有前景的混合结构，天然聚合物如胶原蛋白、明胶和海藻酸盐等机械性能较低，混合光聚合材料可改善结构刚度。

例如，将methacrylate与I型胶原蛋白混合创建的methacrylated type I collagen（MeCol）与碳纳米管（CNTs）生物打印获得导电且有弹性的结构，或使用Gelatin methacryloyl（GelMA）与reduced graphene oxide（rGO）结合改善水凝胶的生物相容性、细胞活性、增殖和成熟，以及增强心肌细胞的收缩性和跳动速率。

构建对齐的心脏组织模型有细胞接种和生物打印两种方法，如使用电纺纳米纤维片培养骨骼肌细胞创建骨骼肌纤维模型，或通过创建各向异性器官构建块（aOBBs）并进行生物打印来实现高收缩功能的心脏组织模型。

（五）脉管系统

在生物制造体外组织和器官模型中，纳入脉管系统至关重要但极具挑战。目前虽取得进展，如使用嵌入式生物打印技术和多种材料（如碳水化合物玻璃、明胶、琼脂糖、Xanthan gum - 配方的逃逸墨水等）来构建血管通道和网络，但仍未成功复制其无处不在的管状3D结构。

例如，通过Miller等人首次报道的使用碳水化合物玻璃在水凝胶基质中制造管状网络，以及后续的研究如使用改性3D打印机和热敏性材料来扩展糖 - 酒精打印的能力，实现复杂自由形式结构的打印，展示了在构建脉管系统方面的不断进步。

（六）骨骼

骨骼主要由无机化合物（60%）和有机化合物（40%）组成，90%为I型胶原蛋白。韧性对工程骨骼ECM样材料至关重要，常用材料如羟基磷灰石（HA）和I型胶原蛋白等常作为更刚性材料的涂层，生物陶瓷如β-磷酸三钙（β-TCP）具有骨诱导和骨传导潜力，但其灵活性和降解速度存在不足。

例如，设计钛植入物并使用I型胶原蛋白涂层，发现涂层和非涂层植入物均允许骨生长，但钛涂层植入物显示出更显著的骨整合。此外，构建模仿体内耳蜗结构及其导电性的耳蜗植入物，展示了对骨骼生物组织电学性质研究的重要性。

脱细胞骨ECM被认为是更有前景的替代方案，因其具有低免疫原性并能保留组织的原始机械性能。

（七）癌症模型

肿瘤细胞在宿主组织的ECM中增殖，导致ECM发生生物物理和生化变化，这些变化影响肿瘤发展并诱导促肿瘤信号。模拟体内肿瘤微环境的ECM结构主要取决于原始肿瘤部位。

例如，选择透明质酸（HA）作为生物墨水的基础来构建脑ECM模拟微环境模型，或使用GelMA创建GBM环境模型，这些模型可用于测试治疗和抗癌药物，如通过3D生物打印构建的3D乳腺癌模型用于药物测试和筛选。

六、结论和未来展望

本综述强调了ECM在组织工程和再生医学中的重要性，探讨了不同的ECM模拟材料和技术，以及它们在保留组织特定结构和设计基质模拟支架方面的潜力。未来需要细胞生物学家、工程师和材料科学家密切合作，发展整合多学科技术的微生理模型，以复制天然ECM的复杂功能。提高ECM模拟物的性能和复杂性将有助于推动从基础病理理解到临床治疗和预防的发展。

参考文献：

Aazmi A, et al. Biofabrication methods for reconstructing extracellular matrix mimetics. Bioact Mater. 2023 Sep 9;31:475-496.