这期我们将主要介绍WB实验的封闭步骤实用干货，大家可以在评论区分享自己的经验和想法!

封闭

封闭

一、封闭的目的

转印结束后，必须将对印迹膜上未被占据的蛋白结合位点封闭掉以防止非特异性探针结合。如果没能将膜上位点全部封闭将会导致印迹膜出现比较高的背景，因为很多检测探针也是蛋白，也会与膜结合。

二、封闭液的选择

通常有两种常用的封闭剂，牛血清白蛋白（BSA）和脱脂奶粉。以下我们简述了这两种封闭剂使用的各自特点和注意事项，帮助选择更适用于您实验本身的封闭剂。

脱脂奶粉:性价比高；通常使用浓度为2.5%~5%；不能用于磷酸化蛋白，因为脱脂奶粉中的酪蛋白本身是一种磷酸化蛋白,会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景。

牛血清蛋白（BSA）:通常使用浓度为2%~5%；某些抗体用BSA封闭会产生比脱脂牛奶更强的信号，确定抗体使用的特殊需求，进行选择适当的封闭剂。

封闭时间一般在1h，避免封闭时间过长导致掩盖抗原表位，阻止抗体结合。封闭后于TBST中洗涤5 min，TBST中的吐温-20去污剂，对抗原具有复性作用，从而提高特异性识别。

三、封闭的条件

室温或者 37℃缓慢摇荡1～2 h，特殊情况也可 4℃过夜。根据结果情况调整封闭试剂的浓度和类型。比如脱脂奶粉的封闭效果更强，但有时 BSA 比脱脂奶粉更有利于降低非特异性背景，而有些抗体则在脱脂奶粉封闭的情况下才能得到清晰的背景。

四、封闭的流程

转膜结束30min，以TBST为缓冲液配置封闭液，并利用涡旋仪、摇床等仪器使封闭液充分溶解并混匀；

转膜结束后，在抗体孵育盒中加入适量封闭液，并用镊子夹住条带，将其完全浸泡在封闭液中，置于摇床上温室摇动孵育1-2h，也可以4°C冰箱孵育过夜。

迷你涡旋仪

摇床

在选择封闭剂时，要注意一些特殊情况：

1. 脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记的抗体一起使用，脱脂奶粉中的生物素会发生交叉反应。

2. 如果封闭剂中含磷酸酶，用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白会受到影响，因为磷酸酶与印迹膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化。

3. 检测磷酸化抗体时，不能使用酪蛋白/脱脂奶粉作为封闭试剂。

4. 辣根过氧化物酶（HRP）检测体系， 不能用含叠氮钠的封闭液，会发生淬灭反应

5. 一般封闭条件为：室温或者37℃/1-2hr，特殊情况也可4℃过夜。

6. 根据结果情况调整封闭试剂的浓度和类型。比如有时BSA 比脱脂奶粉更有利于降低非特异性背景，而有些抗体则在脱脂奶粉封闭的情况下才能得到清晰的背景。

7. 封闭完成后要进行洗膜，以去除膜上未结合的封闭试剂。洗涤液使用TBS-T或者PBS-T，其中的Tween有助于去除非特异性的结合，减少背景。同时短时间多次的洗膜（如5-6次，每次3分钟）比长时间少次数的洗膜更有效

WB实验封闭实用干货就讲解到这里了，敬请期待下一期。