大家好，疫苗是防控传染病的重要工具。但对于一些如HIV等病原体，有效疫苗的研发仍面临诸多挑战。在疫苗接种中，生发中心起着关键作用。近期研究表明——《Two-dose priming immunization amplifies humoral immunity by synchronizing vaccine delivery with the germinal center response》发表于《SCIENCE IMMUNOLOGY》，通过简化递增剂量免疫（EDI）方案，采用两剂初免的方式，能显著增强体液免疫。这一发现为疫苗接种带来新突破，有望提高对疾病的防控能力，但其在临床应用上仍需进一步探索。接下来，让我们深入了解这一研究的具体内容。
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一、引言
疫苗是控制传染病的关键公共卫生工具，但对于一些病原体，如HIV，仍缺乏有效的疫苗。HIV持续对全球健康构成威胁，开发有效的HIV疫苗仍是当务之急。接种疫苗后，生发中心（GCs）在抗体反应的进化中起着关键作用，为免疫记忆的形成提供支持。
二、递增剂量免疫（EDI）的背景及简化探索
EDI的有效性及挑战：EDI通过在较长时间内提供给定剂量的抗原和佐剂，可增强体液免疫反应，如对于稳定的HIV Env 三聚体免疫原，EDI能增加GC和TFH反应、提高B细胞克隆进入GC的数量等，但7剂延长初免方案不适合大规模接种。
简化EDI的假设：基于早期计算建模工作，假设减少EDI至两剂可能有效，即第一剂启动B细胞启动，第二剂在1-2周后提供抗原以捕获在滤泡树突细胞（FDCs）上。
三、两剂初免方案增强体液免疫反应的实验结果
使用稳定的HIV Env SOSIP三聚体免疫原 [N332-GT2]和强力皂苷纳米颗粒佐剂 [皂苷/单磷酰脂质A（MPLA）纳米颗粒，SMNP]在小鼠中进行评估，改变剂量数量、剂量比和剂量间隔。
剂量数量的影响：从先前定义的最佳7-ED方案开始减少剂量数量，随着剂量数量减少，GC和TFH反应的总体规模稳步下降，但从七剂减少到三剂时，三聚体结合GC B细胞的数量仅下降约5倍，而两剂ED模式与单次免疫（bolus）无统计学差异；三聚体特异性血清 IgG 滴度在七剂、六剂、四剂和三剂ED方案相似，但两剂和单次免疫分别低8倍和60倍。
剂量间隔的影响：测试两剂模式在4到12天的间隔，发现间隔7天的两剂递增初免免疫可引发最佳反应，与单次免疫相比，其引发的三聚体结合GC B细胞数量多10倍，仅比先前优化的七剂两周递增给药模式少3倍。
剂量比的影响：第一剂接种20％的疫苗是最优的，增加初始免疫至总剂量的30％或50％会导致反应减弱；优化的两剂方案（第0天接种20％的疫苗，第7天接种 80％）与每周间隔接种两次全剂量疫苗的效果相似，表明第一剂增加额外抗原不能进一步增强GC反应，且该方案增加了GC的规模和识别完整抗原的GC B细胞的比例，与单次免疫相比，三聚体结合GC B细胞的频率增加了6倍。
四、优化的两剂ED初免放大GC反应和抗体滴度的实验结果
比较优化的2-ED方案与单次免疫在不同时间点的体液反应。
在第7天，两组的三聚体结合B细胞均可检测到，并在第14天达到峰值，但2-ED组的总抗原结合B细胞是单次免疫组的5倍；
虽然初始疫苗剂量不同，但在第7天，单次免疫和两剂ED的GC反应相似，到第14天出现分歧；
2-ED组的TFH细胞数量在第7天到第14天急剧增加，在第14天达到峰值时比单次免疫组多约6倍；
三聚体结合GC B细胞数量在第14天也达到峰值，但2-ED方案在第21天仍保持较高数量的抗原特异性GC细胞；
淋巴结浆母细胞在单次免疫和2-ED免疫后分别在第7天和第10天达到峰值，然后逐渐衰减；
2-ED免疫也影响了血清抗体反应的演变，单次免疫引发的IgM反应在第7天达到峰值后稳步下降，而2-ED组在第14天达到峰值；
单次免疫在第7天引发的血清IgG滴度较高，在随后的3周仅略有上升，而2-ED方案在第7天到第14天之间急剧增加，到第14天达到的滴度比单次免疫高约10倍且持续保持。
五、延长初免剂量方案促进先天炎症和TFH反应的实验结果
计算模型预测：开发了一个粗粒度的动力学计算模型来模拟先天免疫反应和T细胞启动，预测延长初免免疫可增强T细胞启动，因为抗原和佐剂的可用性动力学改变会影响TFH细胞的启动，且最佳的EDI免疫需要在整个时间过程中共同施用抗原和佐剂，否则会导致弱TFH启动。
通过荧光标记的N332-GT2三聚体和SMNP佐剂进行免疫实验，分析淋巴结中DC的抗原摄取和激活情况。结果表明，与模型预测一致，单次免疫后，淋巴结中DC和激活的三聚体+DC在2天内增加，然后下降；两剂ED方案的初始剂量在最初2天也有类似效果，但DC数量在第7天第二次剂量前回到基线，第二次剂量后，DC流入的动力学加速，激活的、负载抗原的DC在24小时后显著增加；七剂ED方案中，三聚体+CD86+DC在第12天左右明显积累，与模型预测相符。
六、计算模型预测延长初免免疫可改善天然抗原捕获的实验结果
使用计算模型预测EDI免疫可通过FDC捕获抗原来增加GC反应的大小，并考虑了抗原降解的影响。模型表明，单次免疫后大多数抗原在诱导抗原特异性抗体反应之前就已衰变，形成的免疫复合物很少，导致GC B细胞生存条件严格，免疫优势非天然抗原靶向B细胞占主导；两剂ED方案在第一次剂量后产生针对天然和非天然抗原的弱抗体反应，第二次剂量后抗体与新进入的抗原形成免疫复合物，增加FD上抗原的沉积，削弱了免疫优势等级，使更多GC B细胞结合天然抗原；七剂ED方案在最后一剂（第12天）时抗体滴度已高，导致完整免疫原快速转运到滤泡，使FDC上天然抗原与非天然抗原的比例适度向前者倾斜，从而使天然抗原结合反应更好。
通过荧光标记的HIV Env三聚体进行免疫，对淋巴结进行组织成像和流式细胞分析。结果表明，七剂ED方案在最后一次注射后2天，FDC上存在大量抗原，而单次免疫后几乎检测不到抗原；
两剂ED免疫后也有大量FDC定位的抗原，且通过流式细胞分析发现，两剂或七剂ED免疫比单次免疫使FDC捕获的抗原量分别增加20倍和60倍。此外，在野生型小鼠与补体缺陷小鼠中的实验表明，早期抗体反应对两剂ED方案中抗原在FDC上的捕获至关重要，因为补体缺陷小鼠中淋巴结的抗原捕获大大减少。同时，SMNP佐剂在两剂ED方案中第一次注射时低剂量（1μg/只小鼠）就能有效地消除被膜下窦巨噬细胞，促进抗原在FDC上的积累。
七、延长第二剂免疫时的抗原可用性进一步增强体液免疫反应的实验结果
模拟两剂ED方案中第二剂抗原以恒定速率在10天内释放的情况，发现与两次均为大剂量注射的两剂ED方案相比，延长第二剂抗原释放时间可使更多抗原在高滴度三聚体特异性抗体产生后到达淋巴结，从而以完整状态被捕获在免疫复合物中，使完整抗原在免疫复合物中的比例从约38％增加到92％，进而导致更好的三聚体特异性GC B细胞反应，并且更长的抗原释放持续时间会导致FDC上天然抗原的比例更高，三聚体特异性GC B细胞反应更好。
使用一种稳定的HIV Env三聚体MD39，通过短磷酸丝氨酸（pSer）肽亲和标签与氢氧化铝佐剂结合，实现抗原从注射部位的缓慢释放（约10天）。实验结果表明，给予20％的疫苗剂量作为大剂量注射，80％的剂量作为明矾/pSer-三聚体制剂在第7天注射的两剂ED（明矾-pSer）组与两剂 ED 组的GC B细胞和TFH细胞总数相似，但与大剂量注射的两剂ED免疫相比，明矾颗粒锚定的第二剂在两剂 ED（明矾-pSer）组中使完整三聚体结合GC B细胞的频率增加了2.5倍，绝对数量增加了两倍，与模型预测一致。同时，使用pSer-明矾锚定方法用于两剂方案与仅用于第二剂相比，在三聚体特异性GC反应方面没有显示出改进，表明一旦存在高抗体滴度以捕获天然抗原，恒定释放抗原的益处更相关。
八、讨论与结论
通过系统研究，发现两剂减少的EDI方案（第0天接种20％的疫苗剂量，第7天接种80％的剂量）可显著增强免疫反应，与单次免疫相比，可使峰值抗原结合总B细胞和GC B 细胞分别增加5-10倍和60倍，血清抗体反应增加60倍。
两剂初免免疫促进了FDC上的大量抗原捕获，同时也增加了TFH反应。TFH细胞对GC反应至关重要，两剂免疫导致MHC-II + DC快速增加，促进了T细胞的扩展和启动。此外，延长给药使淋巴结中完整抗原的可用性与发育中的GC反应同步，简化的两剂免疫通过利用预先存在的抗体反应，最大化了免疫复合物中捕获的免疫原剂量，计算模型进一步预测，如果在第二剂时缓慢释放抗原，FDC上天然形式抗原的增加可以进一步促进完整抗原特异性的GC反应。
该研究为设计疫苗接种方案提供了广泛启示，但免疫反应动力学在小鼠与非人灵长类动物或人类中可能存在差异，理想的2-ED方案的给药比例和间隔需要进一步实验评估，计算模型也忽略了GC反应的一些特征。不过，该研究为继续开发相关技术提供了强有力的理论依据。
参考文献：
Sachin H. Bhagchandani et al. Two-dose priming immunization amplifies humoral immunity by synchronizing vaccine delivery with the germinal center response. Sci. Immunol.9,eadl3755(2024).
