转自：优宁维抗体专家
肌动蛋白Actin在活细胞中是一种动态、易变的结构。Actin的染色可用于确定固定细胞和活细胞中细胞骨架的结构和功能。Cytoskeleton作为细胞骨架和小G蛋白研究专家，可提供全面的骨架蛋白染色试剂及方案。接下来，小优分别给大家介绍固定细胞和活细胞中Actin的染色步骤。
2025年1月1日-2月25日Cytoskeleton热销爆品直降54折。本次促销包含Actin染色探针及聚合物检测试剂盒、蛋白翻译后修饰SignalSeeker检测试剂盒、高纯度Tubulin蛋白及聚合检测试剂盒、小G蛋白的GTP结合活性测定试剂盒等。
一、固定细胞中的Actin染色步骤
在固定细胞中，肌动蛋白结构可通过荧光鬼笔环肽（phalloidins）、肌动蛋白抗体来观察：荧光鬼笔环肽只与F-actin的原生四级结构结合，所以具有低背景。抗体识别单体和多聚体肌动蛋白（丝状或F-actin），因此与仅结合F-actin的荧光鬼笔环肽相比，往往具有高背景。另外确保使用适当的固定剂以保持Actin的天然结构至关重要，在使用荧光鬼笔环肽进行actin染色时，推荐使用多聚甲醛作为固定剂，因为多聚甲醛能够保留Actin的四聚体结构，有利于高亲和力结合荧光鬼笔环肽；避免使用冷甲醇，因为甲醇会破坏Actin的天然构象，不利于与荧光鬼笔环肽结合。
1)将3.5μl荧光鬼笔环肽储备液（14μM）稀释到500μlPBS中，制备成100nM的Acti-Stain488Phalloidin工作液。室温下避光保存；
2)取出含有细胞的盖玻片（细胞汇合度50%左右，可视细胞类型优化）；
3)弃去培养基，用PBS轻轻洗一次细胞（室温）；
4)将盖玻片转移到湿盒中，每张盖玻片上滴加200µl固定液（含3.7%多聚甲醛的PBS，pH=7.0），室温固定10min；
5)用PBS轻轻冲洗细胞30s（室温）；
6)每张盖玻片上滴加200µl通透剂（含0.5%TritonX-100的PBS），于湿盒中室温通透5min；
7)用PBS轻轻冲洗两次细胞，每次30s（室温）；
8)滴加200ul100nM的Acti-Stain488Phalloidin工作液，于湿盒中室温避光孵育30min；
9)用PBS冲洗盖玻片三次，每次30s（室温）；
10)（可选）滴加200ul含100nMDAPI的PBS，室温染色30s；
11)（可选）用PBS冲洗盖玻片30s（室温）；
12)用纸巾轻轻擦去盖玻片上的液体，然后倒置在载玻片上，滴一滴抗淬灭封片剂；
13)静置20min晾干，然后用指甲油封住每一面，4°C避光可保存24h。
图1：使用Acti-Stain488Phalloidin对Swiss3T3细胞进行actin染色。整个细胞中actin被染成绿色（图源产品说明书）。
文中部分相关产品：
Acti-stain™488Phalloidin，PHDG1-A（非常稳定的绿色荧光，用于固定细胞Actin染色）
RhodaminePhalloidin，PHDR1（红色荧光，用于固定细胞Actin染色）
Acti-stain™555Phalloidin，PHDH1-A（非常稳定的红色荧光，用于固定细胞Actin染色）
Acti-stain™670Phalloidin，PHDN1-A（远红色荧光，用于固定细胞Actin染色）
1)取出含有细胞的盖玻片（细胞汇合度50%左右，可视细胞类型优化）；
2)弃去培养基，用PBS轻轻洗一次细胞（室温）；
3)将盖玻片转移到湿盒中，每张盖玻片上滴加200µl固定液（甲醇），室温固定10min；
4)用PBS轻轻冲洗细胞2次，每次30s（室温）；
5)每张盖玻片上滴加200µl通透剂（含0.5%TritonX-100的PBS），于湿盒中室温通透15min；
6)用PBS轻轻冲洗两次细胞，每次30s（室温）；
7)每张盖玻片上滴加200µl含0.1%BSA、0.3Mglycine的PBST（PBS+0.01%tween），于湿盒中室温封闭1h；
8)每张盖玻片上滴加200µlAnti-PanActinMouseMonoclonalAntibody（1:250-1:500，PBS稀释），于湿盒中室温孵育90min；
9)使用含有0.1%TritonX-100的PBS轻轻冲洗细胞30s；
10)用PBST冲洗盖玻片三次，每次30s（室温）；
11)每张盖玻片上滴加200µl荧光二抗（稀释比例参考对应抗体说明书）于湿盒中室温孵育60min（尽量减少光照）；
12)用PBS冲洗盖玻片3次，每次30s（室温）；
13)（可选）每张盖玻片上滴加200µlDAPI（稀释比例和孵育时间参考对应说明书）,于湿盒中室温孵育20min（尽量减少光照）；
14)（可选）用PBS冲洗盖玻片3次，每次30s（室温）；
15)用纸巾轻轻擦去盖玻片上的液体，然后倒置在载玻片上，滴一滴抗淬灭封片剂；
16)静置20min晾干，然后用指甲油封住每一面，4°C避光可保存24h。
注意：使用此抗体（Anti-PanActinMouseMonoclonalAntibody，Cat.#AAN02）进行actin染色时不建议使用多聚甲醛固定细胞，建议使用甲醇或多聚甲醛/甲醇固定细胞；而荧光鬼笔环肽染色actin建议使用的固定剂是多聚甲醛（图2）。
图2：不同固定剂对荧光鬼笔环肽、actin抗体的影响（图源产品说明书）。
文中部分相关产品：
Anti-PanActinMouseMonoclonalAntibody，AAN02
AlexaFluor®488-conjugatedAffiniPure™GoatAnti-MouseIgG(H+L)，115-545-003
Fluorescein(FITC)-conjugatedAffiniPure™GoatAnti-MouseIgG(H+L)，115-095-003
AlexaFluor®594-conjugatedAffiniPure™GoatAnti-MouseIgG(H+L)，115-585-003
Cy3-conjugatedAffiniPure™GoatAnti-MouseIgG(H+L)，115-165-003
二、活细胞中的Actin的染色步骤
在活细胞中，可以通过加入荧光标记的肌动蛋白、表达GFP-actin或荧光标记的肌动蛋白结合蛋白亚域来观察肌动蛋白结构。荧光肌动蛋白是最准确的肌动蛋白结构报告物，可通过显微注射或蛋白质转染试剂将其装入细胞。
1)用通用型肌动蛋白缓冲液将罗丹明肌动蛋白重悬至2mg/ml，并添加0.2mMATP和1mMDTT。在冰上放置1小时使肌动蛋白低聚物解聚。注：如果钙离子影响细胞，罗丹明肌动蛋白可在纯水中重悬；
2)将罗丹明肌动蛋白溶液在14000×g4°C下离心10分钟（或100000×g4°C下离心10分钟）。将上清液的90%移至新的EP管中，通过毛细管作用将显微注射针装入；
3)将罗丹明肌动蛋白微量注射到细胞内，保持针内正压，防止堵塞。注意：组织培养基和细胞质中的盐可导致针内肌动蛋白聚合；
4)在温控显微镜平台上使用较低强度的光和CCD摄像机观察细胞。
文中部分相关产品：
Actinprotein(rhodamine,rabbitskeletalmuscle)，AR05
Actinprotein(rhodamine,humanplateletnon-muscle)，APHR
2014年5月25日，NatureMethods杂志发表了一篇具有里程碑意义的论文，介绍了细胞渗透性和无毒性活细胞成像探针（SiR-Actin和SiR-Tubulin）。SiR-actin是一种用于活细胞中F-actin标记的荧光探针。它结合了荧光基团硅罗丹明（siliconrhodamine,SiR）和天然产物jasplakinolide，后者是一种可以稳定F-actin的大环肽天然产物。SiR-actin能够在活细胞中特异性地标记F-actin，并且具有低背景。
01
SiR-Actin活细胞成像探针使用方法
1)制备SiR-Actin储备液：将小瓶中的SiR-actin溶解在50μl的无水二甲基亚砜中，制成1mM的储备液，保存于-20℃。不建议分装成小份（会造成化合物降解更快），另外该化合物不受多次冻融循环的影响；
2)配置染色液：将SiR-actin在细胞培养基（如DMEM+10%胎牛血清）中稀释至所需浓度，并短暂涡旋；
3)准备细胞及染色：当细胞达到所需的密度时，用染色液替换培养基，确保所有细胞都被覆盖，将细胞置于37°C、5%CO2的培养箱中，确定标记时间与探针浓度。
图4：用SiR-actin染色大鼠海马神经元的图像（图源CourtesyOfElisaD'Este,MPIBiophysicalChemistry,Göttingen）。
注意：
(1)由于染色效率取决于细胞系，建议在首次使用时用1uMSiR-actin染色细胞，以快速获得强染色，然后在后续实验中降低SiR-actin浓度，直到达到最佳染色；
(2)一些细胞系可能表达高水平的外排泵，并且被SiR-actin染色不良，可添加10μM的维拉帕米（verapamil，广谱外排泵抑制剂），来改善某些细胞系的染色效果；
(3)SiR-actin也可以对多聚甲醛固定的细胞进行F-actin染色，具体步骤与使用荧光鬼笔环肽进行actin染色的步骤相同。
文中部分相关产品：
SiR-ActinKit，CY-SC001
SiR-TubulinKit，CY-SC002
（转自：优宁维抗体专家）
