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纳米药物载体（NDC）向特定细胞、病变区域或实体瘤的细胞内递送已经进入精准医学时代，需要从多学科角度系统了解纳米生物相互作用。本质上，纳米药物载体（NDC）的开发是为了克服传统游离药物所面临的挑战，并在各种生物医学应用场景中提供巨大的潜力，例如，纳米颗粒（NP）用于成像引导手术、肿瘤的区域热或放射疗养、针对COVID-19的mRNA疫苗的封装、小型设备的制造以及最重要的药物输送。
为此，来自德国慕尼黑亥姆霍兹综合肺病中心（CPC-M）肺部健康和免疫研究所（LHI）的Lin Yang联合中南大学湘雅医院的Jie Chen团队介绍了体外细胞内递送的进展，主要关注被动细胞内NP递送的新兴平台，并简要总结了广泛讨论的主动内吞途径。该综述整合了智能纳米系统工程、生理模型、基于成像的验证工具的最新见解，所有这些都旨在增强NDC的精确和高效的细胞内递送。
相关研究成果以“Bridging Smart Nanosystems with Clinically Relevant Models and Advanced Imaging for Precision Drug Delivery”为题于2024年1月28日发表在《Advanced Science》上。
1. 纳米药物载体(NDC)的细胞摄取途径
揭示NP细胞摄取的分子机制对于开发新颖的递送策略以及智能设计的NDC促进高效的体外、离体和体内细胞内运输至关重要。然而，由于摄取过程的复杂性、多种摄取途径涉及的分子众多、缺乏特定途径抑制剂以及不同细胞类型的异质摄取行为等原因，对NP细胞摄取途径的了解仍然不足。据报道，NP内化到哺乳动物细胞中主要是通过主动内吞作用，包括分别对大颗粒和液体/溶质的吞噬作用和胞饮作用。吞噬作用是在外来NP和微生物引起的先天免疫反应期间由多个免疫细胞进行的，而其他非免疫细胞利用胞饮作用途径进行细胞内摄取，可细分为巨胞饮作用、网格蛋白/小窝介导的内吞作用和网格蛋白/小窝独立的内吞作用（图1）。
图1 纳米颗粒进入细胞的主要内吞途径示意图
2. NDC递送的先进平台
（1）电穿孔辅助NP递送
电穿孔（EP）被称为通过电脉冲对细胞膜进行透化，在细胞膜上形成孔，作为将外来物质运输到细胞内环境的通道。随着纳米技术的发展，电穿孔被用来满足纳米粒子递送的迫切需求，它可以调节影响细胞内药物浓度的三个关键屏障，包括微血管通透性、细胞外基质、和细胞膜。瞬时或永久透化可以分别使用可逆电穿孔(RE)或不可逆电穿孔(IRE)来实现（图2）。
图2 细胞内递送的电穿孔策略
（2）声孔辅助NP输送
超声波产生的声波会破坏细胞膜，以增强纳米粒子和生物大分子的细胞内递送，这被称为声孔作用。超声介导的纳米颗粒内化的基本原理主要包括声辐射力、组织加热和空化作用，其次是对附近细胞表面的生物物理效应，包括气泡振动的推拉效应、微流的剪切应力以及射流或冲击波通过气泡破裂，所有这些都会导致声孔作用并增强组织和细胞的渗透性，以及纳米粒子的渗透和积累（图3）。
图3 细胞内传递的声孔策略
（3）光穿孔辅助NP递送
光穿孔技术是利用光能破坏细胞膜完整性并提高膜通透性的技术。基于各种可能的机制，如光热、光机械和光化学程序，在特定细胞的膜上产生孔，允许外源纳米颗粒的内化扩散（图4）。
图4 细胞内递送的光穿孔策略
（4）基于微流体的纳米颗粒输送平台
与声孔和激光诱导空化类似，微流体辅助递送的最初想法是基于快速水流的流体剪切力，它可以诱导细胞变形并破坏脂质双层以构建细胞内递送通道。由于膜在暂时变形后重新密封，因此由于对细胞活力的影响最小，这种方法对于细胞内递送非常有意义（图5）。
图5 用于细胞内递送的微流体递送平台
（5）纳米颗粒显微注射
尽管颗粒输送效率很高，但通过内吞作用触发颗粒的摄取并不适合那些具有易于降解特征的颗粒。为了实现细胞内精确的隔室递送，并避免负载药物因低pH和降解蛋白酶的恶劣环境而失活，显微注射是将颗粒递送到活细胞内的最直接方式（图6）。使用纳米级玻璃针，纳米粒子以及负载的肽、蛋白质、DNA和药物可以物理渗透到细胞膜。
图6 通过显微注射进行细胞内递送
（6）具有功能化表面的智能纳米颗粒输送系统
尽管人们在通过改变纳米颗粒的特性来提高跨细胞运输效率方面投入了大量的科学努力，但上述许多方法依赖于特定的细胞类型和材料成分。针对特定细胞的定制颗粒在许多情况下提供了提高递送效率的解决方案，但不适用于改变颗粒的物理性质。增强细胞对纳米颗粒主动摄取的灵活策略之一是利用纳米颗粒与细胞的相互作用，因此智能纳米颗粒递送系统逐渐被开发出来。
3. 纳米颗粒的理化性质对细胞摄取的影响
另一方面，纳米颗粒的理化性质对细胞摄取也有着重要的影响。因此，作者在此部分主要对NDC的尺寸、形状、表面电荷、疏水性和弹性等特点进行了系统梳理。
4. 用于体内精确NP细胞递送的分层靶向技术
当NDC递送平台的宏大课题从细胞水平发展到全身系统时，NDC的细胞内积累和保留对纳米技术的高度可控发展提出了新的挑战。NDC增强的细胞内化通常是通过不同的表面电荷或修饰的靶向配体以及随后改善的颗粒和细胞膜之间的相互作用来实现的。然而，同步高效的细胞内化和积累却很难实现。带正电荷的 NDC 与更好的颗粒-细胞相互作用和加速摄取相关，同时在识别和清除方面表现出更高的灵敏度。中性或带负电的颗粒通过EPR效应实现了成功的细胞内积累，但颗粒与细胞的相互作用较差且内化无效。因此，为了实现NDC平台的高细胞摄取和保留，有必要开发可变的特性通过不同细胞/组织/身体进行处理时，满足不同微环境中多种要求的纳米颗粒（图7-8）。
图7 pH触发的表面电荷转换策略的示意图
图8 分层分解以增强肿瘤渗透示意图
5. 模仿体内NP细胞传递的新型生理模型
NDC递送平台的目标是发挥其作为显像剂、药物载体和疗养成分的潜力或效用，用于疾病监测和疗养的临床前研究和临床实践，特别是癌症患者的肿瘤管理。NDC所携带的颗粒的穿透和药物的释放高度依赖于周围的生理环境参数，例如pH、温度和细胞外基质（ECM）构成。因此，传统的2D单层细胞培养不足以评估生理条件下的真实递送效率，而体内模型缺乏影响细胞内纳米粒子命运的具体机制的证据，这鼓励了新型体外和离体生物工程微组织的开发作为模仿体内纳米粒子运输的新颖平台。
因此，作者在此部分讨论了当前最先进的模型，从体外3D多细胞肿瘤球体模型、体外3D器官特异性模型（如血脑屏障模型和气液界面吸入模型）到离体器官模型（包括器官）芯片上（简化）和精密切割的动物或人体组织切片，可应用于满足不同要求的各种NDC条件（图9-13）。
图9 多细胞肿瘤球体（MCTS）模型
图10 模拟血脑屏障的体外模型
图11 模拟吸入纳米颗粒输送的气液界面细胞暴露系统
图12 器官芯片模型
图13 用于研究纳米生物相互作用的具有精确切割组织切片的器官模型
在过去的几十年里，纳米粒子在药物输送、成像、疾病诊断和疗养等生物医学应用中的利用呈指数级增长。研究人员致力于开发新的NDC配方、新颖的递送技术和先进的疗养方案，以最大限度地提高药物疗效并最大限度地减少副作用。将 NDC 有效递送至单细胞、受损组织部位和患病器官（包括实体瘤）需要全面了解跨越多个生物屏障的主动或被动运输途径以及随后的纳米生物（纳米生物）相互作用。到目前为止，活跃的内吞过程已得到充分证明，较小的纳米粒子主要通过网格蛋白和小凹介导的内吞作用被细胞摄取，而巨胞饮作用和吞噬作用则负责摄取较大的纳米粒子及其团聚物。
尽管对纳米生物相互作用的了解不断增加，但包括未探索的在内的多种运输途径可能参与NP内化，反映了NP递送过程中的复杂性。通过膜破坏技术的被动NP递送因此提供了良好控制和高精准细胞内NDC递送的高效能力。由于多种因素，例如NDC类型的变化、不同的细胞类型和生物体、不同的实验条件以及细胞异质性（如耐药细胞与药物反应细胞），文献中仍然可以观察到结果的不一致。在研究新型NDC的体外递送能力时，充分考虑有利的细胞类型、NP特征和递送方法至关重要。
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