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在整个发育过程中，细胞不断地被组织和物化成集体组合，最终形成一个功能齐全的人体。由于其丰富的细胞性质，天然组织能充当指导性生物工厂（例如，生物活性信号提示和细胞外基质（ECM）成分）以及识别传入的刺激并相应地调整其生物特性。尽管在模仿活组织的适应性方面的响应材料取得了显著进展，但细胞传递的独特生命属性超出了当前合成和半合成生物材料的范畴。因此，将人类细胞作为材料前体来制造具有类似组织功能和细胞可编程性的活性材料，是一种很有前景的方法。

来自葡萄牙阿威罗大学的João F. Mano等团队开发了一组通过代谢工程改造的糖蛋白细胞单元，这些细胞单元能够相互连接，充当宏观组织构建块和生物效应器。所产生的人类活性材料，被称为“细胞凝胶”（Cellgels），可以快速组装成各种可编程的三维结构，具有生理相关的细胞密度（高达每立方厘米108个细胞）、可调的机械性能和可操作性。细胞凝胶继承了活细胞感知并响应其环境的能力，显示出自主的组织整合行为、机械成熟、生物学自我修复、生物特异性粘附以及促进伤口愈合的能力。这些活性特征还使得能够模块化地自下而上组装多尺度结构，这些结构让人联想到具有异质组成的人类组织界面。这项技术有潜力扩展到任何类型的人类细胞，开启了利用生物系统内在生物功能的活性材料制造可能性。相关工作以题为“Engineered nascent living human tissues with unit programmability”的文章发表在2024年08月08日的期刊《Nature Materials》。

1.创新型研究内容

本文提出了一种广泛可获取的代谢糖工程策略，使得人类细胞可以作为活性交联剂和活性材料的基本构建块（图1）。利用内源性生物合成细胞机制，生物正交叠氮基团被有效地安装在细胞表面糖蛋白上，允许与环辛炔官能化生物材料进行无催化剂的应变促进的[3 + 2]叠氮-炔烃环加成（SPAAC）偶联。为了作为细胞栓系组分，组织天然存在的细胞外基质中的糖胺聚糖透明质酸被功能性地修饰上了悬垂的二苯并环辛炔（DBCO）部分。通过这种策略，宏尺度和组织密集的活性材料——在这里称为细胞凝胶——完全由带有叠氮基团的细胞与界面糖胺聚糖衍生物的生物正交交联快速组装而成。

图1 组装基于人类的活性凝胶状材料

【通过生物正交细胞间交联组装细胞凝胶】

本文首先关注了人类脂肪组织来源的间充质基质细胞（hASCs），因为它们在组织工程和自体细胞疗法中有着广泛的应用。为了促进细胞表面功能化，Ac4ManNAz以不同的剂量在标准培养条件下给药24小时。与荧光标记的环辛炔耦合证明了糖工程化的糖萼含有带有化学可访问叠氮基团的悬挂唾液酸苷（图2a），因此可以作为活性手柄用于建立活细胞之间的SPAAC连接。流式细胞仪确认了稳健的糖工程过程，显示未修饰的hASCs的存在极少，并且在更高的Ac4ManNAz浓度下叠氮基团显著增加（图2b）。为了扩大可用的细胞单元范围，叠氮功能化在三种不同的人类细胞类型中进一步得到了验证，即皮肤成纤维细胞（hDFs）、脐带来源的内皮细胞（hUVECs）和胰腺癌细胞（hPANC-1）。与基质细胞类似，所有细胞类型中都确认了带有叠氮基团的细胞的存在。在所有细胞类型和筛选的Ac4ManNAz剂量中，细胞表面叠氮的安装都是细胞相容的。与其他方法不同，代谢糖工程提供了一种快速、一步式的被动方法论，其中细胞通过它们在内源性机制下在标准培养条件下自主功能化，因此无需任何耦合剂或特定条件来修改细胞表面。

图2 细胞工程与富细胞生物结构的组装

【细胞栓系促进了组织成熟和自我强化】

在确立这些活性材料的可加工性后，本文使用批量RNA测序来评估在细胞表面插入带有叠氮基团的基序后的细胞反应。层次聚类和主成分分析（PCA）显示了叠氮-hASCs与其天然对应物分离的簇，表明代谢糖工程后基因表达谱发生了变化。差异表达基因（DEGs; Padjusted < 0.05 和 倍数变化 > ±2）的分析揭示了叠氮携带细胞中相对较小部分的DEGs（4%，14193个已识别中的568个）。具体来说，与ECM组织（COL21A1、TNXB和OMD）、分泌因子（ANGPT1、NDNF和GDF6）和糖蛋白（VCAM1、NOTCH4和GPC1）相关的基因发生了改变。这些发现是相关的，考虑到糖工程基序被插入到细胞的糖萼中，这涉及到介导与其他细胞和细胞外组分的相互作用。本文还研究了叠氮细胞集体栓入三维构建体（Cellgels）的影响。与二维（2D）叠氮细胞相比，Cellgels的转录组通过DEGs的层次聚类揭示了广泛的基因表达变化（图3a）。Donut图揭示了Cellgels中存在24.4%的DEGs，其中67.7%是上调基因（图3a）。这些发现通过PCA得到了确认，该分析基于它们的环境（即，2D与3D）将叠氮细胞分成两个明显不同的组（图3b）。此外，火山图分析表明，Cellgel的形成诱导了几个与ECM组织和细胞粘附相关的基因上调（图3c）。在涉及ECM组织的DEGs进一步分析中，发现整合素（ITGA2和ITGB3）、整合素结合唾液酸蛋白（IBSP）、胶原（COL7A1、COL11A2和COL15A1）、其他ECM组分（LAMB3、MATN3和CSGALNACT1）以及ECM重塑剂（MMP8、MMP13和ADAMTS6）的表达增加（图3d）。Cellgel组装导致许多与生长因子（HGF、FGF-16、VEGF和PDGFB）和细胞粘附过程（NECTIN4、HAS1、HAPLN1、VCAM1和ICAM1）相关的基因上调。此外，本文观察到与机械刺激反应相关的基因表达增加（PIEZO2、SOX9和BAG3），表明向3D微环境的转变。这些发现表明，将单个细胞集体栓入Cellgel构建体中诱导了与对3D培养的细胞反应一致的基因表达谱的变化。

图3 细胞凝胶生物结构表征

【细胞凝胶显示出生物特异性粘附和生物自愈能力】

为进一步探索细胞凝胶的生物识别能力，本文评估了它们在接触甲基丙烯酸明胶（GelMA）或聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）水凝胶时的响应，分别代表组织模拟和生物惰性环境。由于缺乏细胞粘附基序，细胞凝胶无法与对细胞来说无法识别的PEGDA水凝胶相互作用，导致PEGDA-细胞凝胶-PEGDA构建体在浸没时解体（图4a）。相反，细胞凝胶识别了组织模拟的GelMA环境，并迅速附着到它们的细胞粘附基序上，通过一个稳定的细胞凝胶连接在3小时内将两个分离的水凝胶块连接起来（图4b）。成熟后（24小时），这些混合构建体（GelMA-细胞凝胶-GelMA）能够桥接垂直间隙，展示它们无缝的结构（图4c）。此外，成熟后保持生物特异性粘性，允许堆叠的细胞凝胶-GelMA构建体的模块化组装。接触GelMA圆盘的细胞凝胶可以在表面上推动，同时拖动附着的水凝胶，突出了这些活性材料中细胞间交联的凝聚力。

图4 细胞凝胶展现出选择性粘附和生物自愈特性

【可编程细胞凝胶混合构建体的生物组装】

内在的生物特异性粘附特性解锁了细胞凝胶与可被细胞识别的水凝胶的模块化组装，产生了具有空间定义的细胞或基于水凝胶的连续构建体（图5a）。除了扩大设计范围外，水凝胶亚基的引入还提供了提供额外组织特定线索或机械支持的机会。为证明这种多功能性，细胞凝胶-水凝胶混合体以多种配置组装，包括两段式立方体、圆柱体和圆盘（图5b）。此外，基于明胶/藻酸盐成分的中空水凝胶纤维可以嵌入细胞凝胶构建体中，以生成混合可灌注结构（图5c）。还制作了不同的同心图案（即，细胞凝胶与GelMA内芯），以展示分层的细胞凝胶-水凝胶结构（图5d,e），显示了低细胞密度hASC负载的GelMA隔室与组织密集的细胞凝胶无缝接口的空间定义区域。

图5 模块化制造多组分细胞凝胶基组合体

【细胞凝胶通过再上皮化加速伤口愈合】

之前在细胞凝胶中展示的类组织特征支持了它们在组织工程和再生医学应用中的潜力。作为概念验证，本文选择了一种体内小鼠切除性伤口夹板模型来评估这些活性材料在促进伤口修复方面的表现。由于这个模型中的伤口固定，伤口愈合通过再上皮化和肉芽组织形成发生，这一过程与人类中发生的过程更为相关。为证明细胞栓系与常规物理嵌入细胞的生物学影响，本文采用了具有匹配硬度、细胞密度（hASC，每立方厘米40×106个细胞）和透明质酸含量（2% w/v）的HA-MA水凝胶作为水凝胶对照组。将细胞凝胶或载有细胞的水凝胶植入小鼠伤口部位，并随时间评估伤口闭合情况（图6a）。宏观观察和伤口痕迹分析显示，随着时间的推移，细胞凝胶治疗显著加速了伤口闭合（图6b,c）。具体来说，在第7天，细胞凝胶组显示出27.0±9.4%的伤口面积，相比之下，水凝胶组为61.0±3.5%，而假手术组为79.0±16.2%。到了第12天，细胞凝胶处理的小鼠只剩下8.8±6.4%的原始伤口面积，相比之下，水凝胶组为61.8±10.3%，而假手术组为61.4±22.0%（图6d）。组织横截面的组织病理学分析表明，到第7天，细胞凝胶显著改善了伤口床的再上皮化，最终在第12天实现了完全（100%）的组织再上皮化，而对照水凝胶呈现了35.7±12.5%的再上皮化（图6e,f）。

图6 细胞凝胶在伤口愈合应用中的体内分析

2.总结与展望

总之，利用本文的方法能够组装具有类似组织密度、单元可编程性以及类似生物系统关键特征的人类活性材料。展望未来，本研究团队设想最先进的遗传工程工具可以扩展细胞凝胶的单元可编程性，达到单细胞水平，允许定制组织特异性活动或安装异质生物功能。在更高的层面上，现有的大量水凝胶库可以与细胞凝胶接口，以整合空间受限的隔室形式增加了另一层模块化，这些隔室具有定制的生物材料成分、不同的细胞内容和功能分级的机械环境。将富含细胞的结构与不同类别的生物材料（即水凝胶、纤维和胶囊）无缝结合的协同作用，可能会产生具有独特属性的新材料类别，这些新材料可能更适合于工程化活体组织类似物。在未来的研究中，这项技术可以进一步与新兴的预血管化技术接口，以生成越来越大的、具有生物功能的复杂异质活性材料。

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