大家好，今天我们来了解一下这篇《Embedded 3D bioprinting–An emerging strategy to fabricate biomimetic & large vascularized tissue constructs》发表于《Bioactive Materials》的一篇综述，在组织工程和再生医学领域，传统方法存在一些挑战，而3D生物打印为解决这些问题带来了希望。嵌入式3D生物打印作为一种先进的技术，能够制造出仿生和大血管化的组织结构。它有哪些独特的方法和优势呢？让我们一起深入探讨，看看它如何为医学和生物领域带来创新和变革。
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一、引言
组织工程旨在制造可移植的组织和器官，传统方法在重现天然微环境、发展异质细胞组织和构建精确形状要求的复杂组织器官方面存在挑战。3D生物打印技术为解决这些问题提供了新途径，其中嵌入式3D生物打印是一种新兴策略。
二、嵌入式生物打印
（一）定义与起源
嵌入式生物打印起源于嵌入式3D打印，最初用于制造应变传感器、软件机器人和复杂器官模型等。通过将生物墨水挤出到具有独特流变特性的支持浴中，以实现高精度的打印。
（二）具体方法
全方位打印：在预设计图案内沉积Pluronic F127逃墨以产生微血管网络，例如在紫外光下（365 nm；5 min）在Photocurable Pluronic F127 - diacrylate中沉积23％（w/w）的Pluronic F127逃墨，形成微血管网络。
GH0ST书写：基于宿主 - 支持材料的超分子组装，使用改性的透明质酸制备功能生物墨水，通过与甲基丙烯酸盐基团改性的透明质酸进行光交联和超分子键合，以稳定结构，例如使用含有1:1比例的Ad - HA和CD - HA（各25％改性）的5％（w/v）水凝胶以及40％改性的HA重复单元混合形成的4％水凝胶进行打印。
颗粒凝胶介质：以Carbopol形成的微凝胶作为支持浴，通过调整床温实现初始凝胶化，加入二价阳离子后进行二次凝胶化，例如使用0.8％Carbopol支持浴打印含有3％藻酸盐和10％明胶生物墨水的Y形构建物。
FRESH：使用直径为55.3±2μm的明胶微粒组成的支持浴，生物墨水在高剪切应力时具有流体行为，低剪切应力时具有凝胶行为，例如使用该方法打印心室模型、血管网络等。
嵌入式多材料挤出生物打印：使用多个生物墨水站和定制的生物打印机，实现多种生物墨水的精确沉积，以制造复杂的多细胞组织构建物，例如使用Pluronics F - 127作为支持介质打印不同颜色和形状的构建物，如心脏、肾脏等。
CLASS：使用琼脂糖作为支持浴来打印和维持低粘度生物墨水，例如使用1％琼脂糖支持浴打印2％藻酸盐生物墨水，并用于培养细胞构建物。
SWIFT：通过使用诱导多能干细胞（iPSC）衍生的球体和细胞外基质蛋白制造人工组织基质，以模仿天然细胞密度、细胞组织和仿生血管结构，例如打印具有不同腔径（0.4 mm - 1 mm）的血管化组织，以及制造可灌注的心脏组织。
体积生物打印：通过聚焦光在光聚合树脂上，一次性创建三维物体，例如使用10％GelMA水凝胶基生物树脂（gelRESIN）和LAP光引发剂（0.037％）打印耳朵、半月板和小梁骨模型。
FLIP打印：使用Fluorinert FC - 40（全氟化油）作为支持浴和薄的光交联水凝胶前体作为可打印墨水，以制造几何复杂的结构，例如打印Marina Bay Sands酒店模型、 geodesic dome、主动脉瓣等。
AAfB：通过抽吸辅助自由形式生物打印技术，将球体收集、转移到储库中，通过压力将其定位到凝胶底物或支持浴上，以制造组织构建物，例如使用1.2％Carbopol支持浴打印DNA链、PSU、软骨和骨样组织替代品等。
（三）优势
不同的嵌入式生物打印方法具有各自的优势，如FRESH方法能够制造大尺寸仿生器官并支持血管化，具有容易的工艺和商业可用性；CLASS系统支持在琼脂糖浆料中培养软组织构建物，促进细胞-细胞相互作用和ECM产生等。
三、设计与理想的支持浴系统特性
（一）支持浴和粘弹性特性
溶胶-凝胶点：通过在流变仪中进行温度扫描测量来确定，对于使用低粘度生物墨水打印构建物至关重要，例如在FRESH打印中，支持浴由明胶组成，需维持在22°C以保持打印结构的形状。
屈服应力和剪切稀化：屈服应力是引发水凝胶流动的最小压力，支持浴在达到屈服应力前应表现为固体，之后转变为流体行为。剪切稀化有助于生物墨水挤入支持浴，例如Jeon等的研究表明藻酸盐微凝胶基支持介质在低剪切应变时表现出固体性质，高剪切率时溶液化。
支持浴稳定性和自愈合：通过时间扫描分析评估，对于长时间打印复杂3D结构如器官模型非常重要，例如Shapira等使用的由海藻酸盐和黄原胶制成的支持介质，能够维持打印形状达18小时。
（二）支持浴透明度
透明支持浴有助于可视化材料沉积、打印图案和结构完整性，例如Ning等的研究表明，支持浴的透明度会影响构建物的机械性能，以及光在其中的穿透对构建物交联的影响。
（三）支持浴毒性
支持浴应具有生物相容性，避免在打印和后处理过程中对细胞造成损害，例如Bessler等的研究评估了支持浴中细胞滞留时间对细胞活力的影响。
（四）肿胀和收缩
打印构建物在支持浴中的肿胀和收缩应最小化，例如0.8％（w/v）Carbopol支持浴可最小化藻酸盐/明胶生物墨水构建物的肿胀和收缩。
（五）提取
使用生物相容性溶液在适当的生理条件下（如溶液温度和pH）去除打印后的构建物，并评估残留支持材料的影响，例如使用PBS或0.9％NaCl，以及使用酶（如 alginate lyase）降解支持浴中的物质。
四、打印参数
优化打印参数对于获得与设计相似的打印对象至关重要，例如打印速度会影响构建物的丝状体宽度，Heo等观察到随着打印速度增加，丝状体宽度减小；喷嘴直径和打印压力也会影响细丝宽度，Jin等的研究表明不同直径的喷嘴和压力会导致不同的细丝宽度；此外，生物墨水的储存模量、剪切稀化和恢复性能也会影响构建物的形状保真度和打印分辨率，例如Afghah等使用不同浓度的Pluronic F127和laponite制备支持浴，发现其粘弹性性质会影响打印效果。
五、稳定策略
生物打印构建物需要通过交联来稳定，以维持形状保真度和机械稳定性，常见的交联方式包括离子交联、酶交联和光交联。
离子交联通过在聚合物之间形成非共价键来稳定结构，几种聚合物如海藻酸盐、结冷胶、果胶和壳聚糖可通过添加钙离子等进行离子交联；
酶交联通过补充酶在支持浴中实现生物墨水部分的共价交联，如转谷氨酰胺酶可用于交联明胶或胶原；
光交联通过聚合物中的光活性基团和光引发剂形成共价键，实现接触-自由快速凝胶化，许多光引发剂可用于诱导凝胶形成，且光交联后的凝胶稳定性较高。
六、用于支持浴制备的材料
多种材料可用于支持浴制备，如Laponite、Carbopol、Pluronics F - 127、Agarose、Gelatin、Gellan gum、Xanthan gum、Methylcellulose和Carboxymethylcellulose、Fluorocarbons等。
这些材料具有不同的特性，例如Laponite是一种合成粘土，具有独特的电荷性质，可形成具有剪切稀化性质的凝胶；
Carbopol常用于化妆品和口腔护理产品中，具有可调的强度和透明度；
Pluronics F - 127具有热响应性；
Agarose在低浓度下常用于组织工程和生物打印，可封装药物和作为牺牲层；
Gelatin可作为生物墨水和支持材料；Gellan gum可形成水凝胶，具有yield stress dependent deformation和smooth flow of materials的特性；
Xanthan gum具有假塑性和剪切稀化行为，常用于增稠和稳定；
Methylcellulose和Carboxymethylcellulose可通过改变聚合物浓度或添加盐来制备可逆和热响应水凝胶；
Fluorocarbons是一种非水性、细胞相容性高的流体，可用于打印大管状构建物。
总之，3D生物打印在制造仿生组织和器官方面取得了显著进展，但仍需要优化、验证和商业化。嵌入式生物打印系统使用支持介质来打印大尺寸组织和器官，防止形状塌陷，但仍需要进一步发展以生产更稳健、无堵塞和成本效益高的打印方法，构建可植入的仿生器官。
参考文献：
Budharaju H, et al. Embedded 3D bioprinting - An emerging strategy to fabricate biomimetic & large vascularized tissue constructs. Bioact Mater. 2023 Oct 21;32:356-384.
