引言
DNA复制是维持生物体遗传信息稳定性的关键过程。然而，DNA复制过程中难免会遇到各种障碍，导致DNA发生损伤，其中DNA双链交叉连接 (ICLs) 是一种严重的毒性损伤。ICLs 会阻断DNA复制和转录，并引发细胞凋亡或癌变。因此，及时修复ICLs对于维持细胞功能和基因组稳定性至关重要。范可尼贫血症 (Fanconi Anaemia) 途径是一种重要的DNA修复途径，负责修复ICLs。该途径的关键组分是FANCD2-FANCI (D2-I)蛋白复合物，它能够识别ICLs并启动修复过程【1】。D2-I 复合物由FANCD2和FANCI两个亚基组成，其中FANCD2 主要负责结合DNA，而FANCI则参与D2-I复合物的组装和功能调控。除了在 ICLs 修复中发挥作用外，D2-I复合物还与其他类型的DNA修复过程密切相关。例如，它在人类免疫缺陷病毒 (HIV) 感染 、CRISPR介导的DNA 修复以及DNA复制压力等过程中，都扮演着保护停滞复制叉的角色【2-3】。停滞复制叉是指 DNA 复制叉停滞在 DNA 损伤处，无法继续前进的状态。停滞复制叉的存在会导致 DNA 损伤积累，并引发基因组不稳定。然而，D2-I复合物的结构和功能机制，尤其是它如何识别ICLs和停滞复制叉，以及它在DNA修复中的作用，仍然是一个未解之谜。
近日，来自英国剑桥大学MRC分子生物实验室的Lori A. Passmore研究团队和帝国理工学院的David S. Rueda研究团队合作在Nature杂志上发表题为FANCD2–FANCI surveys DNA and recognizes double- to single-stranded junctions的研究论文，在该研究中研究人员通过单分子成像和冷冻电镜技术，直接可视化 D2-I 与 DNA 的相互作用，并探究其识别和修复 DNA 损伤的机制。
为了研究D2–I与DNA的结合，研究人员首先制备了荧光标记的D2–I复合物，并使用光镊、共聚焦显微镜和微流体系统将λ噬菌体DNA捕获成哑铃状。结果显示，D2–I能够在DNA上滑动，这与之前观察到的D2–I与圆形或末端封闭DNA的解离速率较慢的结论一致。进一步分析发现，D2–I在DNA上以双向扩散的方式运动，其扩散系数和速度与Cdc45-MCM-GINS复制解旋酶相当，但低于PCNA和XRCC4-XLF。D2–I在DNA上的停留时间较长，可以覆盖几乎整个λ DNA的长度。此外，D2–I的初始加载受到DNA张力和盐浓度的影响，表明其与DNA的结合主要依赖于离子相互作用。与D2–I相比，FANCI单独结合DNA的亲和力相当，而FANCD2则无法结合DNA。这表明D2–I的滑动特性与其构象状态有关，并可能有助于识别DNA损伤。然而，磷酸化和单泛素化似乎不是D2–I在体外进行一维DNA扫描的主要调节因素。研究人员进一步测试了D2–I在遇到障碍物时的行为，以了解它可能如何响应DNA损伤后的不同情况。实验发现，当滑动复合物遇到DNA末端时，它们会反弹并沿相反方向继续扩散，这与冷冻电镜结构中D2–I围绕双链DNA螺旋的观察结果一致。此外，当D2–I遇到含有Holliday接头的线性双链DNA时，它会停滞在Holliday接头的中心区域，并从一半的Holliday接头DNA上滑动。这表明DNA环状结构对D2–I的滑动构成了物理障碍，并且非特异性障碍物会限制D2–I对DNA的扫描。进一步的研究发现，D2-I 沿着双链 DNA 滑动，但在遇到单链-双链 (ss-ds) DNA 交联结构时会停滞。冷冻电镜结构显示，停滞的D2-I与ss-dsDNA交联的相互作用与滑动时不同。因此，D2-I 可以识别 ssDNA 漏缝，并将其锁定在ss-dsDNA交联上。由于ss-dsDNA交联在停滞的复制叉中存在，D2-I可以识别DNA损伤位点。最后的冷冻电镜结构分析表明，D2-I 滑动clamp在DNA上的滑动和停滞具有不同的分子机制。当 D2-I 滑动在双链 DNA 上时，FANCI蛋白的C端结构域与DNA发生静电相互作用，推动 D2-I 沿着 DNA 双螺旋滑动。而当D2-I停滞在单链-双链DNA交界处时，FANCD2蛋白的 KR结构域与DNA发生直接相互作用，将D2-I锁定在交界处，防止其进一步滑动。这种停滞机制对DNA损伤修复至关重要，因为停滞的D2-I可以识别 DNA 损伤部位并保护停滞的复制叉。此外，FANCD2的泛素化可以促进D2-I定位于DNA交联部位，并是DNA 交联修复所必需的。而KR 结构域突变会导致D2-I 的 DNA 结合效率和交联修复能力下降，这表明 KR 结构域在DNA损伤修复中起着重要作用。总之，这项研究揭示了D2-I在DNA修复中的重要作用，并为理解范可尼贫血症途径以及其他类型DNA修复的分子机制提供了重要的见解。D2-I的发现为开发新的DNA损伤修复治疗方法提供了新的思路，并有望为治疗与 DNA 损伤相关的疾病提供新的策略。参考文献
1. Semlow, D. R. & Walter, J. C. Mechanisms of vertebrate DNA interstrand cross-link repair. Annu. Rev. Biochem. 90, 107–135 (2021)。
2. Richardson, C. D. et al. CRISPR–Cas9 genome editing in human cells occurs via the Fanconi anemia pathway. Nat. Genet. 50, 1132–1139 (2018).
3. Wang, L. C., Stone, S., Hoatlin, M. E. & Gautier, J. Fanconi anemia proteins stabilize replication forks. DNA Repair 7, 1973–1981 (2008).
https://doi.org/10.1038/s41586-024-07770-w责编|探索君
排版|探索君
文章来源|“BioArt”
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