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硅酸盐基生物活性玻璃纳米/微球通过释放生物活性离子和形成仿生物磷灰石层促进骨整合，在骨替代方面前景广阔。铜掺杂可增强促血管生成和抗菌等特性。虽然溶胶-凝胶法通常能制备出均匀的纯硅玻璃或二元玻璃球形颗粒，但合成聚集性较差的掺铜三元玻璃纳米/微粒而不产生次生氧化铜结晶相仍然具有挑战性。

来自法国图卢兹第三大学的Jérémy Soulié团队介绍了一种利用溶胶-凝胶化学结合喷雾干燥法制造掺铜三元微颗粒的替代方法。所制备的微球呈现出轮廓分明、聚集性差的颗粒，呈球形，直径为几微米。铜主要以 Cu0 纳米颗粒的形式融入微球，并以 Cu2+ 的形式融入无定形网络。这种掺杂会影响二氧化硅网络的连通性，因为根据掺杂率的不同，钙和磷会优先分布在玻璃网络中（分别作为网络修饰剂和形成剂）或参与无定形磷酸钙纳米域。这些差异会影响与模拟体液的相互作用。网络解聚、离子释放（SiO44-、Ca2+、PO43-、Cu2+）、磷灰石纳米晶层的形成以及铜的释放都会受到影响。后者主要由二氧化硅网络中的铜提供，而不是由金属纳米颗粒提供，后者在相互作用后大部分仍留在微球中。这一认识为潜在的治疗应用带来了希望，为短期和长期提供可调节的铜剂量提供了可能性。相关工作以题为“Spray-dried ternary bioactive glass microspheres: direct and indirect structural effects of copper-doping on acellular degradation behavior”的文章发表在2024年05月07日的国际顶级期刊《Acta Biomaterialia》。

1. 创新型研究内容

本研究旨在证明通过喷雾干燥法合成掺铜三元玻璃的可行性，并了解 i) 铜掺杂率如何直接影响铜的氧化状态及其在喷雾干燥微球中的空间分布；ii) 如何影响二氧化硅网络的连通性和均匀性；iii) 如何影响此类微粒的降解特性及其体外细胞行为。为此，合成了铜含量不断增加的不同样品，并通过透射和扫描电子显微镜、激光粒度仪、固态核磁共振、电子顺磁共振和 X 射线衍射等方法对其形态和结构特性进行了深入研究。通过将粉末浸入模拟体液（SBF），对 BG MPs 的体外细胞反应性和离子释放情况进行了评估。

【溶胶-凝胶和喷雾干燥耦合合成掺铜生物活性玻璃微球】

通过溶胶-凝胶法和喷雾干燥法（图 1）合成了掺铜的 BG 微球，其成分为 SiO2-CaO-P2O5-CuO。通过用铜代替钙阳离子，得到了四种不同铜含量的 MPs。标称成分为 67.5SiO2、(25-x)CaO、7.5P2O5、(x)CuO（%），其中 x = 0、1、2.5、5%。

图1 喷雾干燥法合成掺铜生物活性玻璃微球的原理方案

【合成的掺铜微球】

图 2-a 和 b 展示了 5-BG MPs 的扫描电镜图像，无论掺杂量多少，它们都是具有代表性的微球。它们显示了具有球形形状的清晰而独立的颗粒。这些微颗粒的直径从亚微米到几微米不等。由于液滴溶剂的局部不均匀蒸发，所有样品的颗粒表面都相当粗糙。为实现这一直接观察结果，用激光粒度仪测定了 MPs 的粒度分布。所有四种样品的体积中值直径（D50）都在 3 µm 左右，粒度分布呈双峰型。在 1-10 µm 的范围内可以观察到与单个颗粒相对应的主要颗粒群，而在 10-100 µm 的范围内则可以分辨出另一个小颗粒群。第二个群体是大颗粒聚集体（也可通过扫描电镜观察到），这可能是因为粒度分析仪的压缩空气喷射（3 bar）无法打碎某些聚集体。考虑到 D90 和跨度值，可以认为掺杂 5% 的颗粒比掺杂较少铜的颗粒形成的聚集体更大。然而，正如对致密喷雾干燥二氧化硅基微球的预期一样，SSABET 的面积介于 3 和 4 m2∙g-1 之间，并显示没有内在的开放孔隙。

图2 合成颗粒的扫描电镜显微照片

为检测颗粒的非晶/晶体性质，进行了 XRD 分析，结果如图 3-a 所示。它显示了以 30° 为中心的广泛光晕，是典型的无定形二氧化硅网络。它还显示出 0-BG MPs 和 5-BG MPs 样品中存在少量纳米晶磷灰石（主要峰值（211）在 31.8° /PDF 00-009-0432）。这可能是热处理过程中部分结晶的结果（受二氧化硅基质的限制），因为溶液中的 pH 值太低，无法直接形成磷灰石。除了磷灰石之外，在 43.3° (111)、50.5° (200) 和 74.1° (220) 处还检测到金属铜的衍射峰（PDF 00-004-0836）。有趣的是，颗粒中的铜含量越高，Cu0峰的强度就越高。Cu0晶粒（Lcryst.）的大小是通过 Debye-Scherrer 公式估算出来的，最强烈的峰值为 43.3° (111)。估计的晶体大小介于 60 纳米和 70 纳米之间。因此，XRD 分析表明：i) 铜以 Cu0 纳米晶体的形式存在于颗粒中；ii) Cu0 晶体数量的增加不是由于纳米晶体尺寸的增加，而是由于其数量的增加。

图3 XRD 衍射图

29SiMAS 固态核磁共振（ssNMR）直接偏振（DP）光谱见图 4-a，图中标出了所有典型的共振。这些共振与不同化学种类的硅有关，用 Qn术语描述，以突出其连接性，其中 n 是桥接氧原子 (BO) 的数目。生物活性玻璃的三维硅酸盐网络的主要特征是由四个共价结合的桥接氧原子（Q4）相互连接的 SiO4 四面体，它们可以被一个 H 原子（Si-OH）或加入的碱性或碱土阳离子（Q3 或更低）打破。网络连通性（NC）是一个重要的结构参数，与二氧化硅网络的稳定性有关，因此也与生物活性玻璃的反应性有关。实验中的 NC 是根据对 29Si 共振有贡献的 Qn 种类的百分比计算得出的。

图4 29Si MAS 固态核磁共振波谱

31PDP MAS ssNMR 光谱见图 5-a。确定的峰值对应于不同的磷结构单元，以 QnP 表示，其中 n 是每个磷酸盐四面体的桥接氧原子数。3 ppm 处的主峰代表正磷酸盐四面体与 Ca2+ 离子（Q0P）结合形成无定形磷酸钙（ACP）。正如在 5-BG MPs 的 EDX 图谱中检测到的致密 CaP 区所表明的那样，该共振的确定证实了在合成过程中玻璃结构中稳定了不同的 ACP 纳米域。在 -8 ppm 和 -23 ppm 附近观察到两个更宽的共振，在掺铜样品中更为明显。它们的宽度可能与结构异质性有关，也可能与顺磁性 Cu2+ 离子的存在导致 T2 弛豫加快有关。第一个波段可能是与二氧化硅网络（P-O-Si）或二聚磷酸盐（Q1P）结合的孤立 PO4单元（Q1P）的共振，第二个波段可能是三聚磷酸盐（Q2P）的共振。图 5-b 展示了每个实体（Q0P/Q1P/Q2P）的百分比随掺铜量的变化情况。铜在 BG-MPs 中的掺入大大增加了 Q1P的贡献（二聚焦磷酸钙和与二氧化硅结合的单个正磷酸盐基团），同时出现了Q2P共振（三聚磷酸）。此外，Q1P + Q2P 的总和随铜含量的增加而增加，但Q2P的增加是以Q1P 的增加为代价的。

图5 喷雾干燥 BG MP 的 31P MAS 固态 NMR 光谱

【细胞在 SBF 中的体外进化】

将掺铜生物玻璃微球浸泡在模拟体液模型溶液中 1 小时至 14 天的预定时间点内，对其细胞“生物活性”进行了评估。然后将得到的粉末从模拟体液模型溶液中分离出来，用超纯水清洗，在 60℃ 下干燥，并进行表征。图 6 展示了降解 14 d 后单个和聚集的 MP 的扫描电镜显微照片。无论样品的初始成分如何，与裸颗粒相比，单个颗粒（图 6-b/d/f/h）在 14 d 后表面粗糙度增加，在生物玻璃表面形成了典型的 HA 成核针状晶体。与 7 d 时的颗粒相比，在 SBF 中浸泡 14 d 的样品没有表现出明显的形态变化（图 S7）。然而，“单个”的 MPs 在统计上并不代表大多数 MPs 在 SBF 中浸泡时的行为，尽管它们有助于以简化的方式显示磷灰石晶体的典型形态。事实上，大多数颗粒都排列成大的聚集体，表面覆盖着不规则的羟基磷灰石多层。通过观察 MPs 组的显微照片（图 6-a/c/e/g），颗粒呈现出强烈的聚集趋势，这与未浸泡的 MPs 更加分散不同。从浸泡 24 小时开始，这些聚集的颗粒呈现出典型的表面成核 HA 的“cauliflower”形态。此外，随着时间的推移，特别是在 24 小时到 7 天之间，在 MPs 聚集体表面和颗粒之间的间隙中形成的磷灰石层也在增长。相反，四种 BG MPs 样品之间没有发现相关的形态差异。

图6 颗粒团和单个颗粒的扫描电镜显微照片

【离子释放曲线和 pH 值演变】

通过 ICP-OES 分析 1 h 至 14 d 的 SBF 溶液（包括初始 SBF 溶液），测定了喷雾干燥生物玻璃微球中 Si、P、Ca 和 Cu 元素的离子状况。结果按元素分组，如图 7 所示，并在右侧放大了前几个时间点（0 d、1 h、3 h、6 h）的结果。所有样品都显示出各元素释放的相似趋势，即使浓度值差别不大。最初不存在于 SBF 中的硅曲线（图 7-a）显示，在浸泡的第一个小时内，硅迅速释放，范围为 70-90 ppm。接下来，它开始略微下降，直到 7d 后保持不变。钙浓度（图 7-c）最初也有类似的爆发效应，从 0 d 时的约 100 ppm 到 1 h 时的 300-330 ppm，具体取决于样品。然而，溶解的 Ca2+ 在接下来的几个小时内保持恒定，然后急剧下降，几乎达到与初始值相同的水平。之后，它又回升到猝灭效应时的数值（260-300 ppm，视样品而定），然后趋于平稳。相反，溶解在溶液中的 P 会持续下降，直到浸泡 24 小时后检测不到为止（图 7-b）。最后，与硅和钙的变化趋势相比，掺铜样品的铜曲线（图 7-d）在第一小时表现出爆发效应（1-BG MPs 为 8 ppm，2.5-BG MPs 和 5-BG MPs 为 17 ppm）。此后，1-BG MPs 和 2.5-BG MPs 中的铜浓度变化不大，而 5-BG MPs 溶液中的铜含量继续增加，到 7d 时达到 25 ppm。

图7 喷雾干燥的 BG MPs 在 SBF 中进行体外蜂窝试验（0 d 至 14 d）期间的离子释放曲线。

2. 总结与展望

本研究展示了喷雾干燥工艺作为生物活性玻璃微粒制造中可扩展生产的多功能高效方法的潜力。未来的发展方向包括全面的细胞毒性和抗菌评估，以及将这些生物活性玻璃微球与聚合物结合或功能化以制造多孔支架的前景，这为设计和开发具有定制功能的先进生物材料用于骨替代奠定了基础。

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