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成纤维细胞的簇状集体细胞迁移是损伤组织粘连的主要因素之一。因此，上海交通大学崔文国教授及其团队采用α-螺旋多肽纳米颗粒和抗炎微胶粒构建了微粒生物材料系统，通过α氨基酸-N-羧酸酐（NCAs）和丙交酯的开环聚合制备而成。微粒生物材料系统缓缓释放功能化多肽靶向线粒体，促进炎性环境下细胞外钙离子的流入，从而抑制介导细胞间相互作用的N-钙粘蛋白的表达，促进细胞间细胞凋亡，协同抑制成纤维细胞簇在肌腱损伤部位的迁移。同时，微粒生物材料系统中的抗炎微胶粒通过PEG/聚酯被塞来昔布（Cex）溶解，可长期改善损伤部位的炎症微环境。在体外，微粒生物材料系统可以通过抑制细胞-细胞间N-钙粘蛋白表达，促进细胞凋亡，有效抑制簇状成纤维细胞的迁移。在体内，微粒生物材料系统可以促进细胞凋亡，同时实现长效抗炎作用，降低成纤维细胞中波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的表达。因此，该微粒生物材料系统通过抑制成纤维细胞的簇迁移，为预防和治疗肌腱粘连提供新思路。
相关研究内容以“Prevented cell clusters’ Migration via Microdot biomaterials for inhibiting scar adhesion”为题于2024年4月2日发表在《Advanced Materials》上。
示意图 通过微粒生物材料抑制瘢痕粘连防止细胞簇迁移示意图
本研究中设计了一个α-螺旋多肽纳米颗粒和抗炎微胶粒功能化水凝胶微粒生物材料系统，通过促进细胞外钙内流，抑制N-钙粘蛋白的表达，协同抑制成纤维细胞在肌腱损伤部位的细胞簇的迁移，介导细胞-细胞相互作用，促进聚集性成纤维细胞凋亡，消除炎症。这种微粒生物材料系统在抑制神经、皮肤和关节等其他组织再生的纤维化方面具有很大的潜力（示意图）。
图1 功能化多肽和氧化HAMA（OHAMA）的表征
pLys-BLG的1H NMR（d-DMSO）和化学结构如图1a所示。双胍苯甲酸（BGBA）在D2O中通过1H NMR进行表征（图1b）。功能化多肽（pLys-BLG-BGBA-CDP）的1H NMR和化学结构如图1c所示。用甲基丙烯酸酐对透明质酸（HA）进行修饰，得到HAMA，HAMA的甲基丙烯酸化程度约为60 %（图1d）。高碘酸钠氧化HAMA（OHAMA）的1H NMR和化学结构如图1e所示。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）中可以发现在氧化的OHAMA的1731 cm-1处出现一个醛基信号峰（图1g）。BGBA修饰前后功能化肽表面电位的变化可以进一步证明pLys-BLGBGBA-CDP的成功合成（图1f）。合成的pLys-BLG在约208和222 nm处有一个负双峰带（图1h），表明有一个典型的α-螺旋二级结构。图1i显示多肽自组装成直径为63nm的纳米颗粒。
图2 微粒生物材料的制备与表征
在本研究中，PLGA-PEG-PLGA聚合物具有良好的增溶和疏水药物性能，将高疏水环加氧合酶-2（COX-2）抑制剂的溶解度提高到至少5 mg/mL。增溶效果如图2b所示，Cex@PLGA-PEG-PLGA水溶液形成一个均匀体系。MCP-OHAMA的合成原理和微粒生物材料的详细制备过程如图2a、c所示。在负载FITC@PLGA-PEG-PLGA的微粒生物材料中可以观察到绿色荧光（图2d、e），说明FITC@PLGA-PEGPLGA胶束已成功装载到水凝胶微球中。SEM图像显示冻干微粒生物材料粒径为80μm、具有多孔结构（图2f）。接着评估了Cex的体外释放行为（图2g）。
图3 线粒体靶向能力
采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察线粒体中MCPs的定位，与对照组相比，钙黄绿素复合物MCP和MCPM的绿色荧光明显更强，表明MCPs的细胞内化（图3a）。将MCP与MCPM组相比，绿色荧光强度高度增加，与线粒体探针的红色荧光明显重叠，说明合成多肽的α-螺旋形成的持续释放引发线粒体靶向和定位能力，表明MCP与线粒体共定位。如图3b所示，在对照组细胞中可见强烈的红色荧光，说明未处理细胞的MMP没有去极化；相反，在用MCP和MCPM处理过的细胞中，红色荧光基本消失，显示出明亮的绿色荧光，表明MMP几乎完全摧毁。以上结果表明，MCP和MCPM不仅能靶向线粒体，还能增加细胞内Ca2+的水平，加速线粒体的功能障碍。
图4 N-钙粘蛋白水平与208F细胞密度呈负相关
将三组的细胞密度分别设置为5000、1×104和1×106细胞/mL，模拟单层和多层3D培养的细胞（图4a）。在三组细胞密度均较高的影响下，N-钙粘蛋白的表达均逐渐上调（图4b）。通过免疫荧光法测定三种条件下1×104细胞/mL的N-钙粘蛋白在细胞表面的表达，细胞密度高时，对照组细胞在整个细胞表面和细胞-细胞接触区域有明显染色，而在用MCP或MCPM处理的细胞中，免疫反应性分散在细胞-细胞接触的外围（图4c）。
图5 划痕分析、细胞凋亡分析及微粒生物材料Cex的体内成像
通过细胞迁移实验进一步证实MCPM对肌腱损伤中成纤维细胞群样簇状细胞迁移的影响。对照组的细胞迁移量更高，大约是MCP组和MCPM组的两倍（图5a）。采用FITC-annexin V和PI染色进行了细胞凋亡实验，以验证其诱导细胞凋亡的能力。在208F细胞中，对照组对细胞无不良影响，而其他共同处理则显著诱导细胞凋亡（图5b）。采用近红外荧光染料、疏水荧光染料Cy5.5作为模型药物，模拟药物在体内的释放情况，图5c显示了C57BL/6小鼠局部注射水凝胶微球后，Cy5.5的荧光信号随时间的变化。荧光强度随时间逐渐降低，表明Cy5.5从水凝胶微球基质中持续释放。
图6 体内功能水凝胶微球系统的评价
本研究进一步证实了微粒生物材料系统在大鼠肌腱粘连模型中的发现，示意图如图6a所示。D@MCP组、D@MCPM组与对照组之间有显著性差异，D@MCPM处理的损伤肌腱胶原沉积最有序、最好（图6b）。与未处理的对照组和空白微球组相比，D@MCP组和D@MCPM组形成更多的胶原纤维，并在4周时逐渐形成网络结构。
图7 促进细胞凋亡，抑制损伤部位的细胞迁移
微粒生物材料系统在抑制肌腱粘连方面主要有两种机制，如图7a所示。采用TUNEL法检测损伤肌腱中成纤维细胞的凋亡率，发现D@MCP和D@MCPM处理后损伤肌腱成纤维细胞凋亡率较高，对照组和空白微球组凋亡率较低（图7b）。随后，采用免疫组化方法验证Cex是否能下调MMP-2/9的表达，这与细胞迁移相关，活检及统计结果显示，D@MCP和D@MCPM组均对MMP-2/9有显著下调能力（图7f-i）。且虽然两个治疗组的载药量和模式相同，但D@MCPM在下调MMP-2/9方面明显优于D+M。
图8 在体内评估肌腱愈合状态
如图8所示，术后2周，在未处理的对照组和空白微球组中观察到大量的α-SMA和波形蛋白阳性细胞，代表新生血管组织的出现和肌腱损伤的纤维化过程。D@MCP组中α-SMA和波形蛋白阳性细胞明显少于对照组，而D@MCPM组中几乎没有观察到α-SMA和波形蛋白阳性细胞；术后4周，对照组和空白微球组的α-SMA和波形蛋白阳性细胞仍处于高水平，提示从肌腱愈合向纤维化瘢痕愈合的过渡。在D@MCP组中观察到少量的α-SMA和波形蛋白阳性细胞，因为药物和功能多肽的协同作用仍足以完全抑制有粘连的组织。D@MCPM组对纤维化和血管化的抑制作用最好，说明抗炎肽和功能肽的协同可以有效抑制簇成纤维细胞群，从而降低纤维化和血管化水平。
小结
总之，本研究开发了一种具有α-螺旋多肽纳米颗粒和抗炎胶束功能化微粒生物材料的微粒生物材料系统。一方面，微粒生物材料系统的α-螺旋多肽纳米颗粒同时触发线粒体膜破坏和Ca2+稳态破坏，协同抑制Ca2+依赖的N-钙粘蛋白表达和成纤维细胞凋亡，从而抑制簇成纤维细胞迁移。另一方面，增溶性疏水抗炎药物的持续释放改善炎症微环境。体内实验证实了微粒生物材料系统抑制肌腱粘连的能力，可以促进细胞凋亡，降低波形蛋白和α-SMA的表达，同时实现长期的抗炎作用。本研究首次证明了利用微粒生物材料作为细胞内离子稳态破坏者来抑制簇状细胞迁移。该策略为抑制组织粘连提供了一种新的治疗方法。
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