Dynamic matrices with DNA-encoded viscoelasticity for cell and organoid culture是发表于《nature nanotechnology》的一篇文章，介绍了一种基于DNA的动态交联基质DyNAtrix，用于细胞和类器官培养。DyNAtrix由DNA库与超高分子量聚合物自组装形成，能通过改变DNA序列信息系统控制其粘弹性、热力学和动力学参数。它具有可调的热激活特性，可均匀嵌入哺乳动物细胞，应力松弛时间可调，且具有自愈合、可打印、稳定性高、细胞和血液相容性好以及可控降解等优点，适用于多种细胞和类器官培养，代表了一种可编程的精密基质。

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一、引言

细胞和类器官在三维培养中需要粘弹性基质的机械支持，然而常用的基质材料如Matrigel存在可调性差、批次差异大以及可能意外刺激细胞等问题。本研究提出了一种基于DNA的动态交联基质（DyNAtrix），旨在为细胞和类器官培养提供一种可编程、适应性强的精密基质。

二、材料概念

2.1 合成聚合物：

选择与合成：合成了DNA功能化的超高分子量（UHMW）聚合物，以3兆道尔顿的聚（丙烯酰胺 - 丙烯酸共聚物）为主链，因其具有预期的生物相容性和甲醇响应性。例如，通过自由基聚合合成了衍生物P1、P5和P10，分别具有平均3、20和28个共价连接的DNA链。

功能修饰：为促进细胞粘附和机械信号传导，将含有精氨酸 - 甘氨酸 - 天冬氨酸（RGD）基序的合成肽连接到主链上。RGD - 嫁接的衍生物PRGD和PRGD510与肽 - 游离对应物的分子量相似。

2.2 交联剂设计：

问题提出：初始尝试用简单夹板链在低浓度下交联聚合物时未能产生稳定凝胶，因为无效的分子内键占主导，降低了交联效率。

解决方案：使用基于双夹板设计的复杂交联剂库（CCL），每个CCL成员包含一个在特定温度（T1）下与锚定链结合的适配域，以及一个在另一个温度（T2）下与另一个夹板的重叠域配对的重叠域。

通过引入模糊碱基（N）来多样化重叠域，确保选择性结合。例如，N表示在合成过程中使用A、T、C和G核苷酸等量混合物的位置。

三、CCLs控制网络形成和基质刚度

3.1 统计模拟：统计模拟表明，CCL复杂性和每个聚合物链上的锚定链数量会影响交联效率。为了抑制80％的分子内交联，P1、P5和P10分别需要4、40和60个夹板对。

3.2 实验验证：

交联效率与刚度：通过流变学实验验证了CCL对DyNAtrix交联效率和刚度的影响。增加CCL复杂性可逐渐提高交联效率，当CCL库大小超过CCL - 64时，交联效率不再增加。弹性模量（G′）在宽频率和应变范围内大大超过损耗模量（G″），证明双夹板CCL与UHMW聚合物结合生成稳定凝胶。例如，1%（w/v）P5与不同CCL交联时，交联效率随CCL复杂性的变化。

DNA含量与凝胶性质：与先前报道的具有良好流变学性质的合成DNA交联水凝胶相比，DyNAtrix能在极低的DNA含量下形成稳定的凝胶。CCL64 - 交联的P1和P5的临界凝胶浓度约为0.2%（w/v），对应DNA含量分别为0.05 g l−1和0.26 g l−1，接近聚合物的表观密度，表明凝胶化在聚合物团块开始在溶液中重叠时高效发生。当CCL - 64重叠域直接接枝到聚合物主链上时，可实现更低的DNA含量（低至0.017 g l−1）。

四、DNA序列编码应力松弛和热激活

4.1 应力松弛交联剂（SRCs）：

原理：利用短（≤20 nt）DNA双链断裂所需的力取决于序列组成且随碱基对数量线性增长的现象，通过系统地改变重叠域中的几个碱基开发了SRCs。

效果：SRCs的重叠域在6 - 18个核苷酸之间时，可将应力松弛时间从小于一秒调整到数小时。例如，通过改变重叠域的碱基，使SRCs与不同核苷酸重叠域的DyNAtrix的应力松弛时间覆盖了生物组织的典型范围。

4.2 热激活交联剂（HACs）：

设计：通过在CCL设计中添加阻断链升级为HACs，阻断链在低温下作为保护基团防止过早的重叠域结合，使两种聚合物前体溶液的混合物在4°C时处于亚稳液态，从而使细胞和培养基的混合能够完成，在37°C时阻断链自发解离激活交联剂。

验证：例如，通过流变学实验验证了HACs的作用，加热到37°C时可快速形成均匀的凝胶，且刚度优于无阻断链时。

五、高稳定性、可调降解和生物相容性

5.1 稳定性和降解：

问题：DNA基凝胶容易被血清补充培养基中常见的DNase I意外消化。

实验：通过测试肌动蛋白和柠檬酸的作用，发现50μg/ml的肌动蛋白或10mM的柠檬酸可有效保护DyNAtrix在48小时内不被降解。例如，使用荧光标记的DNA模拟目标进行消化实验，展示了肌动蛋白对DNase I消化的调节作用；

监测DyNAtrix在含血清培养基中随时间的体积变化，验证了肌动蛋白和柠檬酸的保护效果。

5.2 生物相容性：

细胞培养：在肌动蛋白保护的DyNAtrix中培养人间充质干细胞（MSCs），显示出高 viability，优于 Matrigel 和二维培养皿。

结果：例如，培养7天后MSCs的 viability 为91 - 99%，显著高于二维培养皿，在大多数实验中甚至优于Matrigel；

通过活/死染色观察到MSCs在DyNAtrix中具有良好的存活状态。

5.3 免疫反应和血液相容性：

实验：将DyNAtrix与玻璃、Teflon AF和共价交联聚丙烯酰胺进行比较，评估其对单核细胞、粒细胞、补体系统的激活以及血液凝固和血小板激活的影响。

结果：DyNAtrix显示出低的免疫反应和良好的血液相容性，与参考底物相比，单核细胞、粒细胞和补体系统的激活没有显著增加，血液凝固和血小板激活减少。

六、DyNAtrix支持多种细胞和类器官的发展

6.1 hiPSCs：

培养结果：在DyNAtrix中培养的人诱导多能干细胞（hiPSCs）在无肌动蛋白补充的情况下，培养全程基质保持完整，细胞 viability 与 Matrigel 中无统计学差异，能持续增殖并形成空心囊肿，囊肿强烈表达多能性标记OCT4。

例如：通过共聚焦显微镜观察到hiPSC囊肿在DyNAtrix [ + RGD]中生长并表达OCT4；

与Matrigel中生长的囊肿在大小、形态和数量上相似。

6.2 MDCK细胞：

培养结果：培养的Madin - Darby犬肾（MDCK）细胞在无肌动蛋白保护的情况下，血清free培养基中DyNAtrix至少稳定2周。细胞增殖、形成空心囊肿且 viability 高，囊肿形态强烈依赖于细胞外粘附信号的呈现，材料的应力松弛对MDCK囊肿极性有重要影响。

例如：通过共聚焦显微镜观察到MDCK细胞在DyNAtrix [ + RGD]中形成囊肿，且囊肿极性可通过应力松弛调节，使用18 nt SRC时顶端 - 内极性增加到90%（±6%）。

6.3 人滋养层干细胞（hTSCs）：

培养结果：在DyNAtrix中培养的hTSCs能形成滋养层类器官，其数量、大小、形状和 viability 与 Matrigel 中相似，可通过添加重组DNase I实现类器官的释放和连续传代，培养时间可达21天。

例如：通过共聚焦显微镜观察到滋养层类器官在DyNAtrix [ + RGD]中生长并表达相关标记物，如GATA3、GCM1、TEAD4、ENDOU和E - cadherin；

与Matrigel中生长的类器官在形态和标记物表达上无显著差异。

七、结论

DyNAtrix在可编程、自适应的三维细胞培养基质方面具有潜力，其CCL的复杂性决定网络形成，SRCs编码（纳米）机械稳定性，HACs展示可定制的结合动力学。该方法结合了UHMW聚合物主链和交联剂库，降低了DNA浓度，使DyNAtrix具有非免疫原性、成本效益高的特点，可应用于体内，如作为可注射的载细胞凝胶、药物释放系统或医疗器械涂层等。肌动蛋白保护或使用无血清培养基可使细胞长时间培养，DyNAtrix可按需解构，其核酸酶/肌动蛋白调节的降解代表了一种外部控制的替代方案，可替代细胞分泌的金属蛋白酶依赖的基质降解。DyNAtrix提供了一种矩阵工程的混合匹配方法，DNA模块和具有不同性质的聚合物主链可以以各种组合部署。目前正在研究应力松弛时间对各种细胞和类器官模型发展的影响，未来DyNAtrix可能由分子逻辑门和基于DNA链置换级联的合成调节电路自主控制。

参考文献：

Peng YH, et al. Dynamic matrices with DNA-encoded viscoelasticity for cell and organoid culture. Nat Nanotechnol. 2023 Dec;18(12):1463-1473.