此消彼长！为什么在抗生素发明之后，人类依旧饱受病菌的困扰？

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文|史说百家

编辑|史说百家

【前言】

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌，通常是动物和人类严重和慢性感染相关的病原体之一。

其中一些情况能够产生生物膜并引起难以治疗的感染，生物膜形成被定义为细菌聚集和产生细胞外基质的能力，从而保护它们，提高它们的存活率。

并且还允许附着在非生物和生物表面，产生生物膜的菌株对抗菌剂的耐药性增加，这可以通过抗生素和免疫系统细胞对细菌的接触有限来解释。

霉素对生物膜形成细菌菌株活性，究竟会产生多大的影响？

【抗菌药物】

这些菌株对抗菌药物的敏感性降低可能与遗传获得的AR有关，也可定义为表型耐药性（也称为耐受性）。

因为抗菌素耐药性问题日益增多，所以我们需要更好地了解与产生生物膜的微生物相关的感染。

这也促使了人们努力寻找新的解决方案来对抗生物膜相关的耐药性，抗生素与可以破坏生物膜形成的药物的组合是治疗生物膜相关感染的创新策略之一。

N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）是人类和兽医临床实践中广泛使用的药物，它已被应用于治疗对乙酰氨基酚中毒、中耳炎、角膜溃疡、口腔感染，并作为粘液溶解剂用于治疗下呼吸道疾病或子宫内膜炎和子宫内膜异位症。

它还具有抗氧化、细胞保护和抗炎特性，根据已发表的文献表明，NAC与青霉素类、四环素类、氟喹诺酮类和氨基糖苷类药物合用时，对生物膜形成有不良影响并减少其形成，这些相互作用并不总是协同的，其中一些被归类为冷漠或拮抗，具体取决于致病菌株和使用的抗菌药物。

四环素类药物是几乎所有动物中最常使用的抗生素之一，根据欧洲药品管理局（EMA）建议的兽药抗生素的最新分类，如果可能的话，应将其用作一线治疗。

因此找到谨慎和负责任地使用四环素，需要对减少治疗失败病例和耐药性选择风险的可能性进行更多研究，抗菌剂和具有抗生物膜特性的物质的组合可以诱导药物协同作用，并可以增加产生生物膜的细菌的敏感性。

实现这种积极的累积效应，特别是使用四环素类药物（已知具有可转移诱导的AR），仍然是一个重要的必要性，数据的稀缺性及其对四环素和NAC组合对各种生物膜产生微生物的影响的争异性是进行本体外实验的动机。

而我们旨在评估单独或联合使用的多素环素和NAC对产生生物膜的菌株金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌和大肠杆菌的抗菌活性。

在模型微孔板系统中研究了属于致病物种的四种细菌菌株，在MHB培养基中培养期间，将它们与盐酸多西环素和NAC一起孵育，多西环素和NAC的MIC分别在128–0.0625 μg/mL和8000–0.122 μg/mL范围内进行两倍连续稀释。

单独使用强力霉素并与NAC联合使用，对测试的大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌显示出广泛的活性，并且对特定MIC浓度具有很强的抑制作用。

与革兰氏阳性菌株相比，多西环素的MIC值对所研究的革兰氏阴性菌株高2至16倍（表1），而抗生素对两种菌株（金黄色葡萄球菌O74和金黄色葡萄球菌ATCC 25923）生长的影响相似。

同时，NAC对所有测试菌株的MIC值相等，并且高于多西环素，对于抗生素与NAC的组合，大肠杆菌ATCC 25922和铜绿假单胞菌ATCC 27853的MIC值保持不变，两种药物的组合导致金黄色葡萄球菌ATCC 25923和金黄色葡萄球菌O74的MIC值高出四倍。

在多西环素的亚抑制浓度存在下，培养24小时后观察到对病原体的中度至强抑制，当应用强力霉素与NAC的组合时，必须注意从抑制到刺激细菌生长的广泛影响。

【革兰氏阳性】

使用safranin染色方案评估在48°C下培养37小时后测试菌株的生物膜形成，由于所有研究的菌株都被归类为中度（大肠杆菌菌株）到强（金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌菌株）生物膜生产者，因此它们被用于强力霉素和NAC的抗生物膜活性的体外研究。

金黄色葡萄球菌 ATCC 25923、金黄色葡萄球菌 O74、大肠杆菌 ATCC 25922 和铜绿假单胞菌 ATCC 27853 形成生物膜的能力

浓度在0.125至32μg/ mL之间的多西环素抑制所有测试菌株的生物膜，最终形成强力霉素（0.0625–128 μg/mL）的最小生物膜抑制浓度（MBIC）。

单独使用或与 N-乙酰基-L-半胱氨酸（1 μg/mL）和 N-乙酰基-L-半胱氨酸（0.122–8000 μg/mL）联合用于金黄色葡萄球菌 ATCC 25923、金黄色葡萄球菌 O74、大肠杆菌 ATCC 25922 和铜绿假单胞菌 ATCC 278

以1μg/mL的浓度添加NAC的共同给药不会改变大多数测试菌株的多西环素的MBIC，大肠杆菌ATCC 25922除外，多西环素与NAC的组合导致大肠杆菌ATCC 25922的MBIC值增加两倍。

在多西环素浓度≤25922μg/ mL和NAC存在下观察到刺激大肠杆菌ATCC 2生长的趋势，单独或与NAC（1μg/mL）联合使用强力霉素后，两种金黄色葡萄球菌菌株的MBIC值都较低。

多西环素对铜绿假单胞菌ATCC 27853生物膜生长的影响不一致，浓度的多西环素≥32μg/mL能够引起90%的铜绿假单胞菌ATCC 27853生长抑制，NAC的添加没有改变多西环素的活性。

【耐药病原体】

降低选择耐药病原体的风险需要精确和谨慎地使用抗生素，并采取紧急措施寻找现有抗菌剂的有效剂量方案，以对抗生物膜形成病原体，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌致病菌株的耐受性和抗药性通常与它们形成生物膜的能力有关。

因此在体外评估了广泛用于临床和兽医实践的多西环素和NAC的组合，为此选择了大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和高度生物膜形成的气对虾菌株进行研究。

抗生素多西环素和四环素的亚抑制浓度可增强大肠杆菌的生物膜增强作用，或对生物膜包埋的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌几乎无效，此外蛋白结合会降低这些抗生素在体内的抗菌活性。

四环素类药物的蛋白结合率是可变的，据报道，多西环素的结合率为50%-93%，具体取决于药物浓度和鸟类或哺乳动物，所以寻找一种可以增加多西环素对生物膜形成病原体活性的药物具有临床意义。

NAC作为一种药物被广泛讨论，在预防生物膜或在其形成的各个阶段具有抑制作用，NAC可以调节不同组抗生素（包括四环素类药物）的抗菌活性，NAC-抗生素组合可能导致协同、中性或拮抗抗菌活性。

当前实验的数据首次显示了多西环素和NAC组合的不同效果，同时这些影响无法预测，因为它们是菌株依赖性的，与浮游培养相比，生物膜下的细菌细胞对抗生素的反应可能不同。

最初在所研究的24个菌株培养的浮游培养物中测定MIC的值，金黄色葡萄球菌ATCC 74和金黄色葡萄球菌O1两种菌株均对多西环素敏感，MIC值低于30μg/mL的断点，我们的数据与琼斯和史迪威的结果一致。

甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌菌株显示MIC900.12 μg/mL，与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌相比，对多西环素的敏感性高倍，伴 MIC900.5μg/mL[31]，当多西环素与浓度为1μg/mL的NAC联合使用时，其MIC值高出100倍，在稳态条件下，以32mg/kg体重的剂量率连续1日给药后。

这些浓度可在鸡体内达到，尽管两种研究的金黄色葡萄球菌菌株仍然对多西环素敏感，MIC等于4μg/ mL，但多西环素与NAC的给药会降低抗生素对这些革兰氏阳性菌株的疗效，这可能是治疗失败的原因。

我们研究的局限性之一是，由于测试菌株的数量有限且缺乏体内调查，它不允许为临床实践得出强有力的结论，我们也确定大肠杆菌临床分离株中缺乏对四环素的敏感性。

如果研究更多菌株，很难预测NAC对多西环素活性的影响，另一项研究的革兰阴性菌株铜绿假单胞菌ATCC 37对强力霉素敏感，无论是否添加NAC，这与铜绿假单胞菌菌株的报告数据一致，注意到假单胞菌分离株对四环素的敏感性存在很大差异。

这表明需要进一步研究多西环素-NAC相互作用，可以提出，四环素抗生素对革兰氏阴性菌的活性不受NAC的影响。

因为它既没有改变所研究的大肠杆菌和铜绿假单胞菌菌株的多西环素的MIC，也没有改变四环素对相同细菌菌株的活性，我们的数据与已发表的NAC对四环素对革兰阴性普雷沃氏中间体抗菌活性缺乏影响的结果相似。

NAC对致病菌的抗菌特性在以前的研究中有所描述;因此，用我们在浮游培养物实验中包括的四种菌株测试了其抗菌活性。

它们部分由NAC的酸化作用解释，为了证实其他研究的结果，我们发现所研究的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌菌株的NAC的MIC值很高4000μg/mL，铜绿假单胞菌临床分离株NAC的MIC值为3120μg/mL，假中链球菌的MIC值在1560-3120μg/mL之间，外耳道炎犬铜绿假单胞菌临床分离株的MIC值在2500-10，000μg/mL之间。