摘要：数据来源凯瑞德医药科技质谱测试中心
本文基于中药中吡咯里西啶生物碱QE质谱检测方法（EP）的快速筛查和定量分析方法。在两种产地中药（千里光）中均检测到千里光宁。在 15min 内，可以完成 9 种化 合物（欧天芥菜碱 N-氧化物、欧天芥菜碱、毛果天芥菜碱、野百合碱、千里光宁氧化物、克氏千里光碱、芥菜甙N-氧化物、千里光宁、千里光非灵）的定性分析。检出 限为1.6ng/g，定量限为 5ng/g，标准样品 6 次平行测定的相对标准偏差低于 13.8%，精密度 较好。该方法快速、重现性好、灵敏度高，适用于中草药和中成药中吡咯里西啶类生物碱的快速筛查和定量分析。
关键词：吡咯里西啶 生物碱 QE-exactive质谱 千里光 快速筛查 定量分析
世界上约有 3%的有花植物含有 PAs,主要分布于紫草科、菊科及豆科等 。目前已从近 6000种植物中分离得到约 660个PAs 。这些植物中有许多是常见的杂草，会污染用于生产医药产品的植物原料。
PA对植物来说具有化学防卫的功能，在一定程度上可抵御草食动物、昆虫和植物病原的侵害。家畜采食后会导致中毒，并在动物产品如奶、峰蜜和肝脏等中有残留，有致癌、致突变和致畸胎的毒性。PA通过传统草药、茶剂、谷物、功能性食品或奶制品、肉类等食物链的传递被人类摄食。
PAs的毒性主要表现为急性毒性、慢性毒性、基因毒性和特殊毒性等 4种类型。主要表现为肝毒性 ,有的还对肺、心、肾、胰、脑等具毒性及明显的致癌、致突变、致畸胎作用。
吡咯里西啶类生物碱（PAs）是一类分布广泛的植物毒素，大部分具有肝毒性。随着人们对 PAs 毒性认识的不断深入，规定的 PAs 摄入量也越来越严格。2001 年，欧洲食品安全管理局提出食品中 PAs 的每日摄取量应低于 70μg/kg；而 2014 年，欧洲药品管理局要求所有来源的短期口服药中的 PAs 的日摄入限值为0.005μg/kg（按平均体重 65kg）。千里光作为一种常见的中草药，含有较多的阿多尼弗林碱（adonifoline）。中国药典（2015 版）规定千里光中的阿多尼弗林碱含量应低于 0.004%（40μg/g），其他吡咯里西啶生物碱未做规定。PAs 广泛存在于草药、茶叶、谷物中，可以通过食物链传递。因此，迫切需要开发一种快速筛查方法来有效地监测其含量。
目前，主要通过 LC-MS/MS和LC-QTOF对PAs进行鉴定和分析。前处理和色谱分析需要较长的时间。
本应用基于欧洲药典EP2.8.26项下方法建立了千里光中吡咯里西啶类生物碱的快速筛查和定量分析方法。通过中国药典一部千里光项下方法和白背三七中吡咯里西啶生物碱的含量分析及风险评价文献中方法对该方法的结果进行了对比。该方法简便、灵敏、准确，适用于中草药和中成药中吡咯里西啶类生物碱的快速筛查和定量分析。
实验部分
1.1仪器
本实验使用赛默飞公司的QE-exactive高分辨质谱。具体配置为：离子源（ESI），Xcalibur3.1 工作站。
1.2样品制备
样品经超声提取、离心和稀释后，直接进行分析。
具体步骤如下：
1. 准确称取2.0g样品于50 mL 离心管；
2. 加入20.0ml0.28%硫酸水溶液，完全浸湿，超声提取15min；
3. 混合溶液在3800r/min离心10min，取上清液，重复提取一次；
4. 合并上清液，用20%氨水中和至PH为7；
5. 先用5ml甲醇冲洗SPE C18固相萃取柱后，再用5ml水冲洗SPE C18固相萃取柱，样品上清液全部过SPE C18固相萃取柱后，用5ml甲醇洗脱，收集洗脱液，置于50℃温度下氮气吹干；
6. 用1.0ml5%甲醇水复溶，过0.22um有机膜；
7. 取5ul复溶液进样分析。
1.3分析条件
液相条件：
流动相A：5mmol甲酸铵水溶液（0.1%甲酸）
流动性B：5mmol甲酸铵甲醇溶液（0.1%甲酸）
色谱柱：CAPCELL PAK ADME 3um 2.1mm×150mm
柱温：40℃ 样品盘温度：20℃ 进样量：5ul
洗针液：80%甲醇水（0.1%）
表1梯度
时间（min）
流速（ml/min）
流动相A（%）
流动相B（%）
0.0
0.300
95.0
5.0
0.5
0.300
95.0
5.0
6.9
0.300
50.0
50.0
7.4
0.300
20.0
80.0
7.5
0.300
0.0
100.0
10.0
0.300
0.0
100.0
10.1
0.300
95.0
5.0
15.0
0.300
95.0
5.0
质谱部分：
离子源：ESI+ Resolution：70000
Scan type：Full MS Scan range：100-500m/z
AGC target:2e5 Microscans:3
Maximum inject time:200 Aux gas flow rate:15
Sheath gas flow rate:50 Spray voltage(KV):3.5
Capillary temp(℃):270 Heater temp(℃):300
S-lens RF level:60
表2千里光药材的PAs检出种类（提取离子公差为5ppm）
中文名称
英文名称
保留时间（min）
峰面积
CAS号
分子量
提取离子
欧天芥菜碱 N-氧化物
europine N-oxide
10.85
504
65582-53-8
345.39
346.1
欧天芥菜碱
europine
10.45
4645
570-19-4
329.39
330.191
毛果天芥菜碱
lasiocarpine
9.65
12905
303-34-4
411.49
412.218
野百合碱
monocrotaline
10.07
16989
315-22-0
325.357
326.1718
千里光宁氧化物
senecionine N-Oxide
10.56
47306
13268-67-2
351.39
352.219
克氏千里光碱
senkirkine
6.33
331994
2318-18-5
365.42
366.155
芥菜甙N-氧化物
erucifoline N-oxide
6.33
332283
123864-94-8
365.1475
366.1554
千里光宁
senecionine
8.75
2221990
130-01-8
335.39
336.18
千里光非灵
seneciphylline
8.03
3585958
480-81-9
333.38
334.165
结果与讨论
2.1专属性色谱图
图1专属性色谱图及质谱图-安国产地（对照浓度10ug/ml）
图2专属性色谱图及质谱图-亳州产地（对照浓度10ug/ml）
按照 1.3 节的分析条件分析了千里光宁吡咯里西啶生物碱。溶剂空白、基质空白对本方法无影响，专属性良好。安国产地千里光药材检出千里光宁的含量为4.84ug/g；亳州产地千里光药材检出千里光宁的含量为310.7ng/g。
2.2重复性色谱图
图3重复性色谱图（浓度10ug/ml）
按照 1.3 节的分析条件分析了千里光宁吡咯里西啶生物碱，在10ug/ml浓度时，6次测量的 RSD低于10%。结果表明本方法重复性良好。
2.3实测样本与中国药典一部千里光项下方法和白背三七中吡咯里西啶生物碱的含量分析及风险评价文献中方法进行比较
表3三种方法的检测结果对比
方法/产地
中国药典
欧洲药典
文献
安国产地
3.62ug/g
4.84ug/g
未检出
亳州产地
未检出
310.7ng/g
59.1ng/g
本方法检出能力比中国药典和国内文献都高，欧洲药典方法吡咯里西啶生物碱检测种类达到了28种。
结论
基于QE-exactive高分辨质谱，建立了一种测定中草药中吡咯里西啶类生物碱的 快速筛查和定量分析方法。结果表明，该方法能满足日常分析的要求。该方法具有分析时间短、精度高、灵敏度和选择性高等优点。因此，适用于中草药和专利药中吡咯里西啶类生物碱的快速筛查和定量分析。
