在生物学和材料科学研究中,荧光显微镜是一种常用的工具,用于观察和分析微观结构。然而,在使用荧光显微镜时,我们经常会遇到两个重要现象:光漂白(Photobleaching)和荧光淬灭(Fluorescence Quenching)。理解这两个现象对确保实验结果的准确性和可靠性至关重要。本文将详细介绍光漂白与荧光淬灭的机制、影响因素及其在实验中的应对策略。

什么是光漂白?

光漂白是指荧光染料或荧光蛋白在被激发光照射后,荧光强度随着时间的推移而逐渐减弱,直至完全消失的现象。光漂白是一个不可逆的过程,由于光子诱导的化学损伤和共价修饰而永久丧失发荧光的能力,从而失去其荧光特性。需要注意的是,只要是荧光激发,就会发生光漂白,而不同的荧光团受到不同因素的影响导致的光漂白程度也有所不同。

(source: Evident(左) ; Mayumi Nishi in Methods in Enzymology, 2012(右))

光漂白的机制:

·  光化学反应:荧光分子吸收光子后从基态跃迁到激发态,再回到基态时释放光子(荧光)。然而,在激发态期间,荧光分子可能发生光化学反应,形成非荧光产物或与氧气发生反应生成自由基,导致荧光分子永久失活。

·  光子激发次数:每个荧光分子在其寿命期间只能承受有限次数的光子激发。随着激发次数的增加,分子结构逐渐发生不可逆的损伤,最终导致荧光丧失。

·  环境因素:实验环境中的氧气浓度、温度和pH值等也会影响光漂白的速度和程度。高氧环境下更容易发生光漂白,因为氧气会与激发态的荧光分子发生反应生成自由基,加速光漂白过程。

光漂白的速度和程度受多种因素影响,包括:

· 激发光强度和波长:高强度的激发光会加速光漂白的发生。

· 染料分子结构:不同染料的光漂白速率不同,一些染料在激发后更容易发生化学反应。

· 环境条件:氧浓度、温度和pH值等环境因素也会影响光漂白。

什么是荧光淬灭?

荧光淬灭是指在特定条件下,荧光分子的荧光强度减弱或消失的现象。与光漂白不同,荧光淬灭通常是可逆的,去除淬灭因素后,荧光分子可以恢复其荧光特性。许多过程都会导致淬灭现象,例如激发态反应、能量转移、配合物的形成和碰撞淬灭。

(source: Wikipedia)

荧光淬灭的主要机制包括:

1. 动态淬灭:荧光分子与淬灭剂分子在激发态下发生相互作用,如碰撞,导致激发能量被非辐射途径释放。

2. 静态淬灭:荧光分子在基态下与淬灭剂分子形成复合物,抑制其吸收激发光或发射荧光。

3. 能量转移:荧光分子将激发能量传递给邻近的非荧光分子,导致荧光减弱。

4. 环境效应:如pH值、温度和离子浓度的变化可以影响荧光分子的发射特性。

荧光淬灭的程度和可逆性受多种因素影响,包括:

· 淬灭剂浓度:较高浓度的淬灭剂会增加淬灭效应。

· 溶液的物理化学性质:如pH值、离子强度和极性等。

· 温度:高温通常会加速动态淬灭过程。

如何减少或避免光漂白与荧光淬灭?

为了减少光漂白和荧光淬灭对实验结果的影响,可以采取以下策略:

写在最后:

荧光淬灭并不是荧光信号没有了,而是比预想的低,所以淬灭条件下的染料分子仍然可以发出荧光,只是比较弱而已。利用荧光淬灭现象,可以开发很多荧光探针。而荧光漂白是一个不可逆的过程,染料分子漂白后,分子结构已经被破坏,分子无法再发出荧光。正确理解两者的原理机制与关系,有助于我们正确看待荧光激发过程中出现的不同荧光现象,有效改善实验分析。

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