本文来源：中华检验医学杂志, 2023,46(7) : 660-666
本文作者：吴嘉 汪俊军
近年来，国内外关于临床血脂检测及应用方面的指南与共识相继发表；其中《中国临床血脂检测指南》针对临床血脂检测相关阶段概述以及血脂测定项目合理选择与应用等进行了详细阐述，以多学科角度提出相应意见，促进了我国临床血脂检测及应用的进一步规范化和标准化，保障了我国血脂管理工作的有效开展。
临床血脂检测基本项目包括总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C），这是筛查血脂异常患者和服用调脂药物疗效评估的基本组合；另有载脂蛋白AⅠ（apolipoprotein AⅠ，ApoAⅠ）、载脂蛋白B（apolipoprotein B，ApoB）和脂蛋白（a）[lipoprotein（a），Lp（a）]，可作为重点关注对象动脉粥样硬化性心血管疾病（atherosclerotic cardiovascular diseases，ASCVD）风险评估的常规组合。
如今，低密度脂蛋白、高密度脂蛋白颗粒浓度及脂蛋白亚型等相关参数的临床价值逐步得到认可。垂直密度梯度离心（vertical auto profile，VAP）、核磁共振波谱分析（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMRS）、电喷雾差分电迁移率分析（electrospray differential mobility analysis，ES-DMA）、液相色谱串联质谱（liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，LC-MS/MS）等一系列新技术、新方法的日益成熟，促进了更多血脂检测新项目的临床应用与推广，不仅有望改善现有ASCVD风险评估体系的预测能力，或还有利于调脂疗效或新药物安全性的判断，进而指导临床个体化、精准化的血脂管理。本文将重点阐述上述血脂检测新技术方法的检测原理、报告内容及相关现状，并对近年来临床应用的最新研究成果进行分析与总结，旨在为进一步拓宽其应用领域及促进未来血脂检测的规范化及标准化提供参考。
一、血脂检测新技术
1.VAP：该技术是基于密度梯度超高速离心方法分离脂蛋白，再利用特殊的表面活性剂使不同脂蛋白解离胆固醇，再通过胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶反应在连续流动的管路中实时检测吸光度变化，从而获得连续脂蛋白胆固醇图谱；还可利用激光颗粒散射检测技术，对超离法分离LDL组分颗粒数进行定量，再获得LDL颗粒浓度（LDL particles，LDL-P）。
基于VAP技术的全自动血脂谱检测体系，可报告血脂基本项目TC、TG、LDL-C和HDL-C，还包括极低密度脂蛋白（very-low-density lipoprotein，VLDL）及VLDL3亚型、中间密度脂蛋白（intermediate-low-density lipoprotein，IDL）、LDL1~4亚型、Lp（a）、HDL2和HDL3亚型的胆固醇水平及LDL-P；另可报告非HDL胆固醇[即为VLDL、IDL、LDL1~4亚型和Lp（a）的胆固醇之和]、脂蛋白残粒（remnant-like lipoprotein particle cholesterol，RLP）胆固醇（即为VLDL3亚型和IDL的胆固醇之和）；且可提供真实的LDL-C水平结果（即为LDL1~4亚型的胆固醇之和），而传统LDL-C水平结果一般包括LDL 1~4亚型、IDL和Lp（a）的胆固醇之和。VAP血脂分析，能获得更多、更全面、更精准的脂蛋白及亚型新项目的结果报告，可更真实地反映个体血脂水平及变化，从而更有效地指导临床制定个体化调脂方案。
2021年发表的《非空腹血脂检测与临床应用建议》提到了通过VAP等新技术分析血脂亚组分将为更好评估与监控ASCVD剩留风险打开新视角。最新的《中国临床血脂检测指南》也指出VAP等血脂检测新技术临床应用价值日益受到关注，有望实现更精准的个体化血脂分析。目前，VAP血脂亚组分检测仪器及相关试剂盒已在国内获准注册，为进一步扩大VAP血脂检测的临床应用与推广奠定了基础、提供了条件。
2.NMRS：该技术属于光谱学范畴，主要基于在强磁场中带核磁性的分子或原子核吸收电磁辐射从低能态向高能态跃迁的过程中会产生共振谱，经计算机数学模型转换后，可用于分析混合相中的成分数目、类型和相对位置；在临床血脂成分检测中，通过NMRS可测量脂蛋白颗粒表面磷脂、未酯化胆固醇及内核中胆固醇酯、TG末端甲基集团的质子数量，从而确定脂蛋白及其亚型颗粒的质量、数量和粒径大小等特征。
基于NMRS技术的脂蛋白检测，可报告脂蛋白颗粒的平均粒径及5个VLDL亚型、6个LDL亚型、IDL、4个HDL亚型的颗粒浓度，另可提供各类脂蛋白及其亚型的TC、TG分布含量。
国内近期的相关专家共识、建议或指南对NMRS技术在血脂亚组分分析和ASCVD风险评估中的潜在价值进行了认可。2021年美国国家脂质协会的科学声明《心血管疾病管理中的血脂检测实用建议》，推荐NMRS技术检测各类脂蛋白颗粒浓度尤其是LDL-P，可为血脂筛查或初始评估及调脂治疗监测提供合理选择；同时也指出，由于各实验室NMRS仪器设备的不同和/或方法学上的差异，现阶段基于NMRS技术分析的血脂结果仍不具备可比性。新近有研究对比了目前使用较广泛、分别来自德国Numares和美国LabCorp公司的NMRS仪器定量脂蛋白颗粒浓度的结果发现，经2种NMRS仪器检测的LDL-P和HDL颗粒浓度（HDL particles，HDL-P）结果均存在合理、可接受的相关性（相关系数均>0.9）；不同NMRS仪器设备在脂蛋白颗粒粒径界值及系统数据算法上的差异，可能是导致其结果可比性存在偏差的主要原因，这有待相关监管机构进一步规范化和标准化，以解决其结果溯源性的问题。
3.LC-MS/MS：该技术以高效液相色谱为分离手段、以质谱为鉴定测量手段，是一种集高效分离和多组分定性、定量于一体的方法。基于LC-MS/MS的血脂分析，主要应用于更小分子脂类化合物的检测，不仅可作为临床TC和TG检测的参考方法，还能获得个体完整的载脂蛋白谱，有望建立基于LC-MS/MS技术的载脂蛋白检测参考方法，推进临床载脂蛋白检测标准化进程。此外，LC-MS/MS是脂质代谢组学研究的主要技术之一，在多种疾病鉴定脂类标志物、筛选新药物治疗靶点及其作用机制研究等方面均具有重要科学意义。
4.ES-DMA：该技术是离子淌度光谱（ion mobility spectrometry，IMS）分析中的一种，先通过电喷雾接口雾化脂蛋白生成高电荷气溶胶颗粒，再经差分电迁移率分析测量不同大小、不同形状颗粒迁移的平均速率，最后转化为颗粒的粒径分布和数量信息。基于ES-DMA技术的血脂分析，可报告完整的包括不同粒径范围脂蛋白的颗粒浓度。新的美国国家脂质协会科学声明《心血管疾病管理中的血脂检测实用建议》，将ES-DMA技术与NMRS技术作为同等级别进行推荐，是脂蛋白及其亚型颗粒浓度初步评估的合理选择。
IMS还可与质谱技术联合使用，以进一步提高分析特异性、增加分离维度，尤其是在异构体等结构或理化性质相似物的分离及可疑样品干扰物的鉴定方面具有一定优势。目前，IMS-质谱在LDL和HDL亚型分离及其脂质组成分析中的应用仍十分有限；未来仍需考虑在监管条件下制定IMS-质谱的标准化指南，以扩大其在实验室诊断、检测和临床试验中的应用。国外已有相关指导文件的发表，建议了IMS-质谱结果数据报告的标准化流程。
5.微流控芯片电泳技术：该技术是在玻璃、石英、塑料等基片的微细通道中，以电场为驱动力，借助离子或分子在纳升级分子网筛媒介中电迁移或分配行为上的差异，对复杂样品中的多组分进行快速高效分离的分析手段。基于微流控芯片电泳技术可开展LDL和HDL脂蛋白亚型分析，目前国内已有针对HDL2b亚型的检测仪器与试剂盒获准注册。
血脂检测新技术优缺点比较见表1。
二、血脂检测新技术的临床应用
1.VAP技术：一项针对15 397名健康个体的大型流行病学研究，通过VAP技术分析各脂蛋白亚型的胆固醇水平，同时采用IMS技术分析各脂蛋白亚型的颗粒浓度，旨在比较空腹和非空腹时各脂蛋白及其亚型检测结果的差异，发现非空腹时VLDL的胆固醇水平和颗粒浓度均明显高于空腹时结果，但是IDL和小而密LDL亚型的检测结果则不受空腹或非空腹条件的影响。
国内学者以VAP报告的真实LDL-C水平作为参考标准，比较了中国人群采用Friedewald、Martin-Hopkins、Vujovic和Sampson公式计算的LDL-C结果在空腹和餐后条件下的差异，发现空腹时由Friedewald公式计算的LDL-C结果与VAP报告的真实LDL-C水平一致，而Sampson公式则是餐后条件下计算LDL-C结果的更优选择。另一项研究显示，采用VAP技术检测餐后脂蛋白亚型参数，在识别中或高ASCVD风险人群方面的分层价值并不亚于常规空腹血脂检测。
基于VAP技术分析的各脂蛋白亚型参数包括RLP胆固醇、LDL-P、小而密LDL亚型颗粒浓度，可作为颈动脉粥样硬化斑块的检测指标，其诊断价值优于传统TG和LDL-C水平。VAP血脂分析，还有助于全面评估个体ASCVD风险或合理选择调脂药物，尤其适用于高TG血症及某些遗传性血脂异常的特殊患者。
2.NMRS技术：有研究通过NMRS技术分析青春期至成年期的血清脂蛋白特征，发现休闲时间体育活动与VLDL颗粒大小、浓度及其TG含量呈负相关，与HDL颗粒大小、浓度及其TC浓度呈正相关；该结果支持了关于青少年体育活动的建议，以促进健康并降低潜在的ASCVD风险。在常规血脂正常的肥胖青少年中，通过NMRS技术检测的LDL-P特别是小LDL亚型颗粒浓度能可靠反映其心脏受累严重程度、合并代谢综合征等情况；可见NMRS血脂分析能为ASCVD早期预防或血脂管理提供更多有效信息。
跟踪LDL和HDL颗粒中脂质成分TC、TG分布的细微变化，有助于一般人群或健康个体的ASCVD风险评估。一项汇总4个大型队列15 784名非ASCVD参与者的研究，对比了常规HDL-C和NMRS技术检测的HDL-P分别对缺血事件综合结局方面的预测价值，随访8~12年，发现基线HDL-P在总体人群中始终与心肌梗死、缺血性脑卒中的个体终点呈负相关，比HDL-C更具价值。另一项基于社区队列研究纳入1 507名大于71岁的参与者，随访27年，发现通过NMRS技术检测基线小HDL亚型颗粒浓度是老年人长寿的关键决定因素之一；在临床实践中的寿命预测方面，HDL亚型颗粒参数比常规血脂组合更具优势。
基于NMRS技术分析的各脂蛋白亚型参数，例如针对VLDL和LDL亚型的分析，可鉴别不同冠状动脉病变严重程度的不稳定性心绞痛患者；针对不同HDL亚型的分析，可预测冠状动脉粥样硬化斑块破裂风险及主要心血管不良事件的发生。国内一项多中心队列招募1 991例2型糖尿病患者，中位随访时间5.2年，发现NMRS技术检测的基线HDL-P及小HDL亚型颗粒浓度均与糖尿病患者的ASCVD和全因死亡率呈负相关，比传统危险因素更有助于糖尿病患者不良结局的预测和ASCVD剩留风险的评估。
一项针对118 461名英国生物样本库队列参与者的大型流行病学研究，通过NMRS技术发现并识别出一系列当前健康或未来疾病的生物标志物；这些血浆中大量存在的脂质及代谢产物，并不仅仅局限于心脏代谢性疾病，还与多种常见疾病的患病率、发病率和死亡率相关联；该项工作突出强调了基于NMRS技术分析代谢生物标志物对公共卫生研究和转化的价值。已有研究开始运用NMRS代谢生物标志物的数据，涵盖疾病风险预测、因果分析、基因发现和药物靶点验证等多方面的相关应用。目前，国内也有研究采用NMRS技术初步建立了中国健康成人血脂各亚组分的参考区间，这将为NMRS血脂分析在我国ASCVD防治和风险评估方面的临床应用提供基础依据。
3.LC-MS/MS技术：在直接定量分析血清各类载脂蛋白方面，LC-MS/MS技术应用已较成熟。近年来靶向降低Lp（a）水平是临床调脂治疗研究领域的热点问题，有研究通过LC-MS/MS技术检测了接受他汀类药物治疗后Lp（a）仍高和不高患者的载脂蛋白（a）[apolipoprotein（a），Apo（a）]水平差异，并结合电泳和蛋白免疫印迹结果计算了Apo（a）的产生率和分解代谢率，发现经他汀治疗后Lp（a）颗粒浓度仍高可能是其肝脏生成增加的结果，这为靶向Apo（a）合成的调脂策略提供了动力学依据；另有研究利用LC-MS/MS技术发现补充ω-3脂肪酸可降低接受他汀类药物和/或依折麦布治疗的家族性高胆固醇血症患者餐后富含TG脂蛋白中的Apo（a）水平，这为ω-3脂肪酸在TG和Lp（a）升高患者中的代谢作用提供了新见解；还有研究通过LC-MS/MS技术检测了接受前蛋白转化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9）抑制剂治疗前后患者Apo（a）水平变化，结合Apo（a）亚型大小分析，发现Apo（a）分子越大，经PCSK9抑制剂治疗后Lp（a）降低更为明显；Apo（a）的多态性特征是PCSK9抑制剂诱导Lp（a）降低疗效的独立决定因素；在如今个体化治疗时代，这将有助于临床选择PCSK9抑制剂降低Lp（a）获益更多的患者；可见，利用LC-MS/MS技术开展Apo（a）水平的检测对临床靶向降低Lp（a）治疗评估具有重要的参考和指导价值。
此外，LC-MS/MS技术还可检测鞘磷脂家族成员神经酰胺等新指标应用于识别急性冠状动脉综合征、糖尿病、脑微出血或卒中患者的心血管和全因死亡风险。基于LC-MS/MS获得的循环神经酰胺和磷脂酰胆碱水平可建立心血管事件风险测试评分体系，能有效预测冠状动脉疾病患者的剩留心血管事件风险。
4.ES-DMA/IMS技术：通过IMS分析脂蛋白及其亚型颗粒浓度有助于识别胰岛素抵抗个体，与TG/HDL-C的组合可进一步改善单一指标对胰岛素抵抗的预测能力。一项针对2型糖尿病患者为期2年的营养性酮症随机对照临床试验，发现极低碳水化合物饮食诱导的营养性酮症可降低患者小LDL亚型颗粒浓度、升高较大LDL亚型颗粒浓度，但对总LDL-P、ApoB及颈动脉内膜中层厚度进展均无影响；可见利用IMS技术检测脂蛋白及其亚型颗粒浓度，能为2型糖尿病患者的饮食管理提供指导意见。在美国国家心肺和血液研究所资助的一项动脉粥样硬化多种族前瞻性队列研究中，纳入6 814名非ASCVD参与者，平均随访5.9年，通过IMS技术检测的基线LDL-P尤其是较小LDL亚型的颗粒浓度与冠状动脉钙化评分、颈动脉斑块进展评分均密切相关，且独立于传统LDL-C等水平分析；该结果进一步突显了IMS血脂分析在总体和剩留ASCVD风险评估中应用价值。
5. 微流控芯片电泳技术：通过该技术开展的临床应用研究近年多为针对HDL亚型的检测分析。国内学者通过微流控芯片电泳技术平台发现高水平HDL3和低水平HDL2b百分比与队列人群中代谢不健康或肥胖状态有关；其中HDL2b颗粒可能通过负调节淋巴细胞活化来发挥了抗炎作用，有望作为未来代谢疾病的潜在治疗靶点。另有报道采用微流控芯片电泳技术发现多囊卵巢综合征患者的血清HDL2b百分比降低，这可能是增加其动脉粥样硬化以及冠心病发生风险的重要因素。目前，大多是微流控芯片电泳技术仅限于科研实验室的研发阶段，由于缺乏独立检测平台的限制，在实现自动化、大通量检测方面仍有一定提升空间，相关仪器和试剂的实用价值仍有待进一步的临床验证。
三、LC-MS/MS技术在血脂测定标准化中的应用
LC-MS/MS技术有利于载脂蛋白及其亚型的同时定量、分型及标准化。近年来，国际临床化学和实验室医学联合会成立了质谱法定量载脂蛋白工作组，旨在通过LC-MS/MS平台建立基于蛋白特征性肽校准的血清ApoAⅠ、ApoB、ApoCⅠ/Ⅱ/Ⅲ、ApoE、Apo（a）可溯源的新型多重参考测量系统，为上述7种血清载脂蛋白的标准化进程奠定科学和技术基础；目前，开发的Apo（a）候选参考测量程序已获得国际临床化学和实验室医学联合会认可，并将进一步建立运行该参考测量系统的可持续的校准实验室网络；该法是基于质谱技术对蛋白水解消化后产生的特定蛋白肽片段进行直接测量，对Apo（a）亚型不敏感，特别是使用基于非kringle特异性Apo（a）定量肽作为校准物质时有望获得准确的Lp（a）nmol/L结果，从而与基于免疫法测量的Lp（a）nmol/L结果具有良好的线性相关性。此外，美国华盛顿大学基于靶向定量Apo（a）的LC-MS/MS技术，使用由人重组Apo（a）组成的参考物质进行校准，开发了血浆Lp（a）nmol/L检测的候选参考方法，该法可溯源至SI单位并不受Apo（a）亚型的影响，与免疫法测量结果可比。上述研究也进一步突显了LC-MS/MS技术在Lp（a）测定标准化方面的潜力。
四、展望
临床血脂检测是血脂异常防治和ASCVD风险评估的重要组成部分。基于VAP、NMRS、IMS及LC-MS/MS等新技术、新方法的高级血脂分析策略，可提供更多、更全面的个体化血脂谱，进一步促进了脂蛋白颗粒浓度及各脂蛋白亚型、亚组分检测的临床应用与推广，有望提升ASCVD总体风险尤其是剩留风险评估的预测能力，进而指导临床对调脂治疗方案的调整或优化。然而，目前血脂检测的高新技术，大多基于不同的脂蛋白/脂质分离原理，又或是检测的脂蛋白/脂质不同的生物学特性、结构、大小等，其数据结果的可比性、一致性尚难以保证，因此未来血脂检测的发展趋势应更加重视新技术方法的规范化和标准化问题，以便更好地应用于临床血脂筛查与管理等工作。
近年来随着检验医学的发展和多学科交叉的协同攻关，血脂检测逐渐形成个体化、精准化的综合解决方案，旨在应用更优、更完整的血脂、脂蛋白及其亚型参数或者神经酰胺、磷脂等脂类新指标，开发更自动化、更高通量、更低价的血脂检测体系平台，致力于强化血脂筛查与管理的重要性，从而提高个体ASCVD风险评估与分层的准确性，最终改善ASCVD防治现状，进一步增加临床获益。
本文编辑：干岭
