来源：石家庄凯瑞德医药科技发展有限公司

1、 什么是微生物负荷与微生物限度？

生物负载（微生物负荷）是指产品和/或无菌屏障系统上或其中的存活微生物的总数，是多种微生物污染源所产生的微生物总和，这些微生物污染来源包括原料药、辅料、生产设备、生产环境、生产工艺、生产用水和成品的包装材料等，是一种定量方法。

微生物限度：微生物限度检测是一个控制项目，涉及到产品最终质量标准的制定，是一种对非无菌产品进行定性和定量的方法。

2、 微生物负荷与微生物限度有何主要区别？

在生物负载测试中，总活菌计数是作为一个整体来计算，而在微生物限度检查中，需要分别对需氧菌、霉菌和酵母菌、特定微生物分别计数。

3、 微生物负荷与微生物限度检测方法有何异同？

两者都需要对检测方法进行适用性方法验证，区别主要在于（1）、试验菌株阳性菌有所不同。都需要使用5种菌株进行适用性试验，但微生物负荷还需要用到需氧菌芽孢（枯草芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌）（2）、供试品样品制备不同。微生物负荷需要考虑样品取样，微生物采集方法，回收率一般不超过100%，而微生物限度回收率要求一般为50%-200%（3）控制菌检查要求不同。微生物限度根据产品物料性质、使用用途不同，控制菌的检查要求不同，而生物负载要求无菌产品中间产品不得检查耐热菌，如有检查需要进行耐热菌沸水测试，D值鉴定，必要时候需要进行菌种分离鉴定。（4）检验结果不同。微生物限度检查需要分别对需氧菌、霉菌酵母菌、控制菌进行计数报告，与产品放行直接相关。而生物负载测定只需要计入总数，与无菌保证水平相关。

4、 中国GMP无菌药品附录中有关于微生物控制的相关描述吗？

附录中，第三章第十一条：应当对微生物进行动态监测，评估无菌生产的微生物状况。监测方法有沉降菌法、定量空气浮游菌采样法和表面取样法（如棉签擦拭法和接触碟法）等。动态取样应当避免对洁净区造成不良影响。成品批记录的审核应当包括环境监测的结果。

对表面和操作人员的监测，应当在关键操作完成后进行。在正常的生产操作监测外，可在系统验证、清洁或消毒等操作完成后增加微生物监测。

第十章 生产管理第五十二条：应当尽可能减少物料的微生物污染程度。必要时，物料的质量标准中应当包括微生物限度、细菌内毒素或热原检查项目。

第五十八条 应当根据所用灭菌方法的效果确定灭菌前产品微生物污染水平的监控标准，并定期监控。必要时，还应当监控热原或细菌内毒素。

第十四章 质量控制第八十条：无菌检查的取样计划应当根据风险评估结果制定，样品应当包括微生物污染风险最大的产品。

5、 最终灭菌产品微生物负荷应该如何监测？

在《中国新GMP指南：无菌制剂》中：应该依据所采用灭菌/除菌方法的有效性和热原污染的相关风险，制定灭菌前微生物负荷的控制标准，必要时应制定灭菌前热原或细菌内毒素控制标准。控制灭菌前微生物污染水平是控制产品热原污染的主要手段。最终灭菌产品一般采用的标准如下：企业可以根据自身情况制定灭菌前药液的微生物负荷标准，原则是确保每个容器在灭菌后无菌保证水平达到1 0 -6。微生物负荷标准的制定应有依据和理由，常见的如每100ml药液中污染菌不超过lOOcfu ( 有些企业以单位容器来规定限度），当以体积数制定标准时，针对体积较大的产品（如透析液），需要根据产品规格制定相应的标准。

6、 最终灭菌产品微生物负荷取样方法、取样量有何规定？

灭菌前微生物污染水平监测的取样应考虑正常生产的整个过程，应基于风险评估选取最有代表性的样品，且要充分考虑到产品从灌装到灭菌前的放置时间。

通常灌装后段配制药液储存的时间最长，微生物滋生的风险增加，应对灌装后段产品进行取样，监测微生物污染水平。如果灌装持续时间较长，根据验证结果确定取样的时间和频率，如从每批产品灌装开始、中间及结束时分别取样，取样量一般不少于100ml。

7、 最终灭菌产品微生物负荷批检验频率有何规定？

采用过度杀灭法的灭菌工艺经过风险评估以适当的频次进行监测；采用残存概率法的灭菌工艺，为确保每一单元容器生物负荷符合要求，应当对每一批药液进行监测，同时应根据灭菌前微生物污染水平监测结果开展污染菌耐热性检查。

8、最终灭菌产品微生物负荷测试方法是什么？

参考《中国药典》非无菌检查方法，使用经验证过的检验方法定量过滤药液，若样品有抑菌性，应根据企业开发的方法，对抑菌性进行处理，如采用中和剂冲洗，将此滤膜移至胰酪大豆蛋白胨培养基琼脂平板上，在30〜3 5 ℃培养3〜5 天，计数。

耐热性检查：对于灭菌前微生物污染水平监测中发现有污染菌的产品，应采用合适的方法对疑似存在的耐热菌进行耐热性测试，如沸水测试或D 值测定。

8、 何时进行微生物D值测定，测定方法是什么？

经确认为耐热菌，可考虑进行微生物D 值测定，测定方法有残存曲线法和阴性分数法。具体可参考《中国药典》通则9208生物指示剂耐受性检查法指导原则。

9、 非最终灭菌产品微生物负荷如何规定的 ？

最终除菌过滤前非最终灭菌产品微生物的限度标准一般≤10cfu/l00ml。

10、非无菌原辅料、化学药品微生物控制策略应该如何制定？

建议参考国家局CDE《非无菌化学药品及原辅料微生物限度研究技术指导原则》。

11、什么是洋葱伯克霍尔德菌群？

洋葱伯克霍尔德菌群（Burkholderia cepacia complex，Bcc）是一类来源广泛、由20余个伯克霍尔德菌属的近缘种组成的革兰氏阴性条件致病菌，具有较强的耐药性。对于某些水性基质非无菌化学药品，Bcc是不可接受微生物。对于吸入用途的非无菌制剂以及口服、黏膜、皮肤和鼻腔给药的水性基质非无菌制剂，应参照相关技术要求对洋葱伯克霍尔德菌群进行风险管理和控制研究，制定相应的控制策略，必要时将Bcc订入产品放行/注册标准（登记标准）。

12、为什么需要控制洋葱伯克霍尔德菌群？

洋葱伯克霍尔德菌是一种机会性病原体，主要在免疫功能低下的人群中引起疾病。易感染的特定人群包括老年人、幼儿、癌症患者、孕妇和慢性病患者。虽然洋葱B.cepacia在完全干燥的表面上似乎不能存活超过一周，但它可以在水中存活数月。这种微生物能够在恶劣条件（例如有机溶剂、防腐剂、低营养物质等）下存活数月。参照PDA TR67中：“表2：与产品召回、非无菌制剂引起的感染及临床感染相关的常见微生物种类”，与洋葱伯克霍尔德菌有关的产品召回事件在所有召回事件中（N=144）占据首位（出现34次），也占据着大众视野。该菌已经被美国FDA列为不可接受微生物。从产品召回中吸取公共卫生问题的教训，通过评估有16次代表性的召回与BCC污染相关的。6次召回是根据FDA的调查结果自愿发起的，10次为企业自愿召回。产品类型包括洗眼液、鼻喷雾剂、漱口水、防龋漱口水、护肤霜、婴儿和成人用毛巾、手术用准备布、电解质溶液和不透射线制剂。BCC甚至在含有一种或多种抗菌防腐剂的情况下也对这些产品进行了污染，所用的防腐剂有苯扎氯铵、氯化十六烷基吡啶、葡萄糖酸氯己定、柠檬酸、重氮唑烷基脲、过氧化氢、乳酸、对羟基苯甲酸甲酯、山梨酸钾、对羟基苯丙酯、硝酸钠，这些抗菌成分是药物制剂中的常见成分，从高效到温和的抑菌或杀菌活性不等。虽然似乎没有一类或一组抗菌化合物特别有利于BCC的耐药性，但这些物种能够在常见的药物防腐剂存在下持续存在。

13、洋葱伯克霍尔德菌群有耐药性吗？

BCC是多药耐药菌。BCC细菌的多重耐药性似乎是由于各种外排泵有效地从细胞中去除抗生素，由于BCC形成生物膜的能力，抗生素与细菌细胞表面的接触减少，以及细胞膜的变化降低了膜对抗生素的渗透性。BCC也对许多消毒剂和清洁剂有抵抗力，并且不受包括聚维酮碘在内的许多防腐剂的影响。BCC是临床实验室中遇到的最具抗微生物药物抗性的微生物之一。这些菌株通常对所有已知的抗微生物剂具有抗性。具体来说，制造商不能依靠防腐剂来控制BCC。但可以通过其他可靠的方法解决污染问题，例如过程控制和无菌产品制造。为了防止这种机会性和适应性病原体的风险，制造控制措施必须不仅包括有效的清洁、消毒和干燥设备，但也必须将几乎任何水源都视为潜在的污染源。水是制药生产中最常见的原材料，而饮用水是BCC的常见来源。制药用水的处理和保存方式可以最大限度地减少微生物数量、内毒素以及有机和无机化合物。BCC耐药现状表现为，对氨基糖苷类抗生素和多粘菌素等高度耐药(耐药率普遍高于94％)，对氯霉素和磷霉素也有较高的耐药率(大于60％)；半合成青霉素中的阿莫西林、氨苄西林、阿莫西林+克拉维酸和第一、二代中的头孢菌素中的头孢噻吩、头孢呋辛及单环β-内酰胺类氨曲南的耐药率高(耐药率大于50％)，对哌拉西林、哌拉西林+他唑巴坦、第三代头孢菌素中的头孢他啶、头孢哌酮+舒巴坦和复方新诺明的耐药率均较低；对米诺环素和美罗培南较敏感。

14、洋葱伯克霍尔德氏菌的菌落特征、生理生化特征是什么？

曾命名为Pseudomonas cepacia，革兰氏阴性杆菌，严格需氧，细胞大小0.8-1.0×1.6-3.2μm，单独或成对存在，可通过极性鞭毛运动。最适生长温度为30-35℃，4℃不生长，几乎所有菌株都可在40℃生长，大多数菌株可在41℃生长。氧化酶阳性，但反应时间较长且反应较弱。可将硝酸盐还原为亚硝酸盐。分离自腐烂的洋葱、土壤以及各种临床样本。

15、怎样用16S rDNA基因测序鉴定洋葱伯克霍尔德氏菌？

分离纯化 、核酸提取、 PCR扩增、核酸扩增产物的检测、扩增产物的纯化、核酸测序、数据库比对、确认鉴定结果

16、替代微生物检验分析方法验证需要做哪些内容？

建议参考USP<1223>微生物替代法验证、EP5.1.6 控制微生物质量等章节对非传统微生物方法进行方法开发验证。

17、PCR和MALDI-TOF质谱鉴定微生物的原理是什么 ？

将基因扩增法和质谱法结合使用可以用来检测特定微生物和进行微生物鉴定。PCR首先在一个或多个目标序列中使用引物和探针。在一个系统中，PCR扩增的序列或扩增子被转移到硅胶条或MALDI-TOF质谱上。在分离的系统中，扩增子被引入到电喷射离子-TOF质谱中。基于的核酸成分和长度不同，扩增子被电离后，它们会进入检测器中，将最终的图谱与信息库中已知的微生物的图谱进行对比。此项技术可以用来检测包括病毒的更广泛的微生物，在单个样品中可以检测多种微生物。

18、什么是基因序列测定？

基因序列测定用于细菌、酵母菌、霉菌和支原体多种微生物的鉴别。其科学原理是当PCR扩增后，为特定的DNA的核苷酸碱基排序。通常，使用16S rRNA前500对碱基，但是为了得到更精确的结果也使用全部的16S rRNA。

首先从细胞的纯培养物中将DNA提取后，然后通过PCR扩增；扩增需四种脱氧核苷酸碱基：腺嘌呤（A）胸腺嘧啶（T）鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）。然而，使用这些标准的核苷酸和双脱氧核糖核苷酸的混合物时，后者在其脱氧核糖糖上缺乏3’-羟基。因此，在扩增反应中，当有双脱氧核糖核苷酸被结合时，PCR引物的扩增将终止。因此DNA片段的长度会有不同。由于每个双脱氧核糖核苷酸标有不用的荧光染料，就形成了标有荧光扩增序列的副本。这些副本的分子重量不同，因此可以使用毛细管电泳法对其进行分离和检测。通过同时分析代表四个脱氧核苷酸碱基的四个反应混合物，基因序列软件会将对所要分析的序列进行线性重组。把最终的序列与信息库中已知的微生物序列进行对比，如果序列匹配，即可作为种属的鉴别。