临床级细胞的微环境工程（二）：细胞产品制造策略

生物工程方法，包括生物反应器、生物材料和微生理系统，可以提供改善各种细胞和基因治疗产品制造和特性的方法。生物反应器和生物材料可提供不同的条件（如流体流动、粘附信号、机械信号和/或微体系结构）来精确控制适合细胞的理化微环境，以增强细胞复制并维持功能特性。

用于细胞制造的生物反应器、生物材料和微生理系统的潜在用途

细胞与基因产品制备流程：

首先，从自体或异体经过分离和纯化得到种子细胞。

接着，在可提供独特微环境（生物反应器和/或生物材料）中，将细胞培养扩增到满足临床治疗。但是，获得的细胞在关键质量属性上可能是异质的。

微生理系统 ，可通过结合特异的病变细胞（如癌细胞），鉴定分离的细胞（在细胞不需要扩增的情况下）或经过扩增制造的细胞，用以确定这些细胞产品的质量属性，判断是否可用于患者临床治疗。

根据FDA定义，微生理系统由微流控装置、类器官和3D细胞培养系统组成，可提供一定的组织微环境，制造符合人类生理特征且治疗有效的细胞产品。

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细胞产品的先进制造策略

用于临床级细胞扩增的生物材料

用于临床级细胞扩增的生物材料：

(a)涂有IL-2的介孔二氧化硅微棒和抗CD3/CD28修饰的流体脂质双分子层，增强了原代 T 细胞的扩增能力。

(b)大孔透明质酸支架为NK细胞提供三维微环境，增强其扩增能力。

(c)水凝胶通过提供3D微环境，减少氧相关代谢，减少活性氧的产生，增强HSC的扩增。

(d)聚乙二醇(PEG)水凝胶，可增强传代的MSCs的细胞因子分泌。

T细胞扩增需要三种信号刺激，包括：T细胞受体；共刺激信号；促生存细胞因子。T细胞扩增方法有两种，一是用DC细胞刺激，二是用抗CD3/CD28免疫磁珠刺激。单核细胞衍生的DC细胞制备比较常见，但成本太贵。抗CD3/CD28免疫磁珠，则不能提供生理相关的刺激因素。因此，采用不同刺激性、共刺激性和促生存细胞因子的生物材料系统，很可能提供更有效的方法来扩增 T 细胞。

生物反应器，提供动态培养环境和自动扩增程序，也被用于扩增原代T细胞。采用免疫磁珠培养CAR-T细胞实验表明，与静态培养相比，通过搅拌式生物反应器培养搅拌速度越快，细胞扩增的效率越高。

德国美天旎开发的 CliniMACS Prodigy，是一种全自动多功能细胞处理系统，可以为CAR-T细胞的分离、病毒转导和细胞扩增提供一个自动化、封闭的系统。这种系统已经在临床级CAR-T细胞的生产制造中被证实是靠谱的，一共生产过28种CAR-T细胞，这些细胞用于CD19+ B细胞恶性肿瘤的治疗的 I 期临床试验。Lonza公司的Cocoon，另一种封闭式生物反应器系统，可用于CAR-T细胞的分离、病毒转导和扩增。

人体外周血中NK细胞和DC细胞含量较低，需要进行体外扩增才能满足临床治疗用量。人类NK细胞，可通过IL-2进行体外扩增。但人类DC细胞，还不能进行体外扩增，目前只能依靠从外周血直接分离。

1.DC细胞扩增

体外扩增DC细胞不易，只能直接分离外周血。在IL-4和GM-CSF同时存在的条件下，血液中的单核细胞分化为未成熟的DC细胞，随后经过抗原和细胞因子（如TNF-a、PGE2和/或LPS）刺激，最终变成成熟的DC细胞。

生物反应器，可用于DC细胞的扩增。德国美天旎提供的CliniMACS封闭式生物反应器与培养袋联合使用，利用血液里的单核细胞可以生产制造出功能成熟的DC细胞。使用这些细胞培养袋，可降低污染风险，易于DC细胞扩增。一般来说，生产制备的成熟DC细胞和天然的DC细胞表型没有显著差异。在动态中空纤维生物反应器中，培养单核细胞变成功能成熟的DC细胞，数量不会减少，且具有一次性处理单个单采的优势。

为提高NK细胞的扩增效率，基于生物反应器和生物材料的策略陆续出现。有证据表明，在组织培养瓶、氟聚合物细胞培养袋和波浪式生物反应器三种体系中，发现生物反应器培养的NK细胞，纯度和功能性细胞毒性更高。

此外，与2D培养的NK细胞相比，3D培养的NK细胞可产生更多的细胞因子、增殖效果更强，抗肿瘤功效更好。在多孔胶原海绵中，培养NK细胞也有类似的效果。

与骨髓相比，脐血来源的造血干细胞（HSC），诱发移植物抗宿主病（GVHD）风险较低，但脐血来源数量较少，治疗受限制。如果规模化临床，就需要进行规模化扩增。

在基于聚丙乙烯（含有可溶性细胞因子和小分子）的2D培养基上扩增HSC，通常会造成HSC干细胞的丢失、扩增有限和归巢能力降低。这可能是缺乏体内HSC生态位的模拟微环境所致。

在生物支架中扩增HSC，可提供具有不同粘附和机械相关的3D微环境，可更好保持细胞干性并促进细胞增殖。与二维培养相比，3D培养显示出更好的把持原始HSC群体的能力。在纤维蛋白多孔支架上，HSC增殖程度最大。 利用培养基稀释法来扩增HSC，能够降低分化HSC分泌的抑制因子的浓度，HSC数量可增加11倍。生物材料和基质细胞共培养的系统和生物反应器，可以进一步增强造血干细胞的扩增.

在免疫调控和组织修复的临床试验中，需要大量的间充质干细胞（MSCs）。因为从组织里获取的MSCs较低，而临床所需的细胞数量较高。国际共识是，临床标准输入量是1X10*6个细胞/kg体重，也就是说一个50kg的人，如果要进行干细胞的移植的话，需要5000万个MSCs。

细胞治疗产品的静态扩增是最常用的方法。缺点比较明显，成本高、劳动密集、无法精确控制培养参数，以及治疗潜力逐渐下降。例如，在二维平面培养中，随着体外传代次数的增加，MSCs失去了其功能免疫调节、成骨和成软骨能力。

生物反应器已经被用于间充质干细胞的扩增，可提供动态的培养条件，增强扩增能力，和降低成本。微载体系统（包括多孔、可生物降解的聚己内酯微载体），可使MSCs在搅拌过程中获得更大的生长。商用CultisSphere-S，由微孔明胶包裹的微珠组成。比起波浪生物反应器，将微载体与旋转瓶生物反应器配合使用，细胞产率更高。在聚乙二醇（PEG）水凝胶中进行培养MSCs，可增强传代的MSCs的细胞因子分泌。

用于临床级细胞扩增的生物反应器

用于临床级细胞扩增的生物反应器案例

(a)在搅拌罐生物反应器中，动态培养原代 T 细胞，可增强 T 细胞的增殖。

(b)在波状生物反应器中，动态培养NK细胞，可提高NK细胞的细胞毒性和纯度。

(c)在带有粘附的BMSC的中空纤维生物反应器中，培养HSC，可增强HSC的扩增。

(d)在搅拌罐生物反应器中的微载体上，培养MSCs，可使细胞生长更大。

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