上回我们讲解了WB实验的原理和实验步骤中的蛋白提取和研磨仪，这回我们将主要介绍WB实验中的电泳步骤和电泳仪。

WB实验步骤

电泳

分离胶浓度6%/8%/10%/12%/15%，搭配上层胶溶液B中的红色或绿色染料，多种搭配任你选择，蛋白点样孔清晰可见，提高点样效率。

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清洗玻璃板

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配置分离胶和浓缩胶

根据目的蛋白分子量和所选电泳缓冲液不同，选择合适浓度的SDS-PAGE下层胶，参照表格如下：

配制10% AP溶液：称取AP（过硫酸铵）粉末0.1 g，用1mL纯水完全溶解。该溶液4℃存贮1-2周有效，-20℃保存3个月有效；

根据实验需求，等比例混合对应的溶液A和B，加入适量的10% AP溶液，分别配制下层胶溶液、上层胶溶液。不同规格以及不同厚度的玻璃板可以等比例调整上层胶和下层胶溶液的配制体积。

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制胶

向两块玻璃板中间胶室中缓慢注入配制好的下层胶溶液至胶室的三分之二到四分之三处（根据实际实验需求来定），然后使用双蒸馏水左右移动均匀加至胶室内，使其起到密封作用（加样时请务必小心，避免产生气泡）。静置15-30 min左右等待凝胶聚合，倒出双蒸馏水，并用吸水纸清理胶室残留液体。

使用配制的上层胶溶液加样灌满胶室（高度至凹板玻璃缺口上沿），随后插入加样梳子。等待约15-30 min凝胶完全聚合后，制胶过程完成。

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上样电泳

等浓缩胶凝固好，拔掉梳子，如果点样孔弯曲，可用上样针拨正，之后可上样，Marker孔加入5-10μL蛋白Marker，其余蛋白总上样量30-50μg。将制胶器放进电泳槽，倒入电泳缓冲液，连接电泳电源（PW-600），将电压调至 60-90V ；样品进入分离胶之后，将电压调至 120-150V，等到溴酚蓝指示剂距离胶最底部大约 1cm，即可终止电泳。

Tips

1、注意保证上样体积尽量一致，否则可能导致蛋白条带不在同一水平线；如有空置的加样孔，需加等体积的1×loading buffer，以防相邻通道蛋白样品的扩散；上样时需缓慢加，切忌快速吹打以免引起蛋白样品溢出，此外，上样体积要小于上样孔的总体积。

2、电泳液一般要求内槽加满，外槽加到 1/4 即可。1.0mm 玻璃板最多点样 20μL，1.5mm最多可以点 40uL; 浓缩胶电压需要根据温度来选择，室温较高，电压低一些，室温较低，浓缩胶电压高一些（夏天一般建议浓缩胶电压 75V，冬天 90V,分离胶固定为 150V 高电压。

选购电泳仪考虑的因素

价格：根据您的预算和实验需求，选择适合的电泳仪。

体积：根据实验室空间大小选择合适的电泳仪，确保其能够方便地放置在实验台上。

稳定性：电泳仪的稳定性对实验结果有很大影响。应选择性能稳定、不易出故障的电泳仪。

分辨率：分辨率是评价电泳仪性能的重要指标，高分辨率的电泳仪可以更好地分离样品中的蛋白质。

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WB实验步骤和电泳仪就讲解到这里了，敬请期待下一期。