MolCell|RAPIDASH新技术：无标记富集核糖体相关蛋白

引言

核糖体在基因表达调控中十分重要，尤其是通过核糖体相关蛋白（RAPs）来调控翻译。RAPs在神经发育和免疫反应等许多生物过程中发挥重要作用，但由于缺乏有效的识别不同组织和细胞类型中的 RAP 的方法，难以对它们进行深入研究。常见的研究方法具有缺乏特异性、依赖遗传编辑和处理步骤繁琐的缺陷：密度或大小分离法，通过密度或大小对细胞裂解物进行分级，缺乏特异性【1】；Ribo-FLAG免疫沉淀（IP）法，则依赖于核糖体核心蛋白（RPs）上标记FLAG标签的遗传标记，无法在组织或患者样本中应用【2】；活性核糖体捕获-MS（ARC-MS）是一种使用Click化学来分离核糖体和RAPs的新化学方法，需要样本处理（如使用叠氮基高代氨酸），并且倾向于识别翻译早期阶段的核糖体，导致样本偏向【3】。

近日，斯坦福大学的Maria Barna和UCSF的Davide Ruggero团队合作在Molecular Cell上在线发表了题为RAPIDASH: Tag-free enrichment of ribosome associated proteins reveals composition dynamics in embryonic tissue, cancer cells, and macrophages的文章，开发了一种叫做RAPIDASH的RAPs富集方法，能够跨越多种样本类型和环境，富集并分析核糖体相关蛋白的组成动态。

RAPIDASH方法用一种带有巯基的硫键树脂，通过与核糖体RNA的特异性结合，富集核糖体及其相关的蛋白质。RAPIDASH显著富集了核糖体蛋白，较以往的超速离心方法，RAPIDASH显现出更高的特异性和有效性，能够识别大多数核糖体蛋白及相关的翻译因子。

图1：RAPIDASH流程示意图：细胞质裂解物经过蔗糖垫超速离心和巯基树脂层析，富集含有RNA的高分子量复合物（Credit: Molecular Cell）研究团队使用这种方法处理了多种生物样本，包括小鼠胚胎组织、癌细胞和受刺激的巨噬细胞，并通过质谱分析（MS）鉴定富集的蛋白质，研究RAPs的动态变化。他们将RAPIDASH技术应用于小鼠E12.5阶段的胚胎组织，包括前脑、肢体和肝脏，富集并分析这些组织中的RAPs，发现前脑中特异性富集的RAPs（如Dhx30和LLPH）可能与神经发育相关，例如，LLPH在长mRNA转录本的翻译中起关键作用，这对神经系统的发育至关重要。为了探索核糖体组成如何在肿瘤进展中发生变化，他们将RAPIDASH技术应用于前列腺癌细胞系PC3，分析在抑制mTOR信号通路前后，核糖体及其相关蛋白的变化。通过质谱分析鉴定核糖体相关蛋白的变化，发现在抑制mTOR信号后，eIF4G1等翻译起始因子与核糖体的结合减少，这表明mTOR信号通路调控了特定RAPs的翻译功能。他们还探究了巨噬细胞在免疫激活后的RAP重构，通过RAPIDASH技术富集巨噬细胞在TLR3和TLR4免疫激活后不同时间点的核糖体，分析其组成的动态变化，发现免疫激活后，许多参与抗病毒反应的RAPs如IFIT家族蛋白显著富集。这一结果表明，核糖体不仅是蛋白合成的机器，还参与了免疫反应的调控。综上所述，这个研究验证了RAPIDASH技术在小鼠胚胎干细胞中的应用，并将这个技术应用于组织特异性功能中。同时癌细胞和免疫细胞中的实验展示了RAPIDASH技术能揭示癌症和免疫反应中核糖体的动态变化。

模式图（Credit: Molecular Cell）

参考文献

1. Mehta, P., Woo, P., Venkataraman, K., and Karzai, A.W. (2012). Ribosome purification approaches for studying interactions of regulatory proteins and RNAs with the ribosome. Methods Mol. Biol. 905, 273–289. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-949-5_18.2. Simsek, D., Tiu, G.C., Flynn, R.A., Byeon, G.W., Leppek, K., Xu, A.F., Chang, H.Y., and Barna, M. (2017). The mammalian ribo-interactome reveals ribosome functional diversity and heterogeneity. Cell 169, 1051– 1065.e18. https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.05.0223. Bartsch, D., Kalamkar, K., Ahuja, G., Lackmann, J.-W., Hescheler, J., Weber, T., Bazzi, H., Clamer, M., Mendjan, S., Papantonis, A., et al. (2023). mRNA translational specialization by RBPMS presets the competence for cardiac commitment in hESCs. Sci. Adv. 9, eade1792. https://doi.org/10.1126/sciadv.ade1792.https://doi.org/10.1016/j.molcel.2024.08.023

责编|探索君

排版|探索君

文章来源|“BioArt”

End