作者：杭州惠世微生物研究中心
微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。是评估非规定灭菌产品受微生物污染情况的质量控制方法，主要确保产品安全稳定，防止品质问题和健康风险，涉及到水质、医药、食品和日用产品等多个领域。
微生物限度检查包含定量和定性评估，定量指需氧菌和霉菌酵母菌总数，定性则指不得含控制菌。常用方法包括常规法、静置上清液法、培养基稀释法等，其中薄膜过滤法和平皿法常用于微生物回收和计数。
中国、美国和欧洲药典均有微生物限度标准，但具体限度有所不同，分别针对不同类别产品制定。总之，微生物限度是确保产品质量和安全的关键指标，通过严格检测和控制可有效预防微生物污染风险。
本文杭州惠世生物研究中心主要针对微生物限度检验（薄膜过滤法）菌液的稀释与制备、微生物计数方法学验证、控制菌验证及再验证等展开介绍。
.验证用菌株及菌种要求
.验证用菌株 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌、铜绿假单孢菌作为细菌计数验证用菌株，需确保生物学特性稳定，传代次数不超过5代。
.菌种保藏技术 为确保试验菌株的生物学特性，应采用适宜的菌种保藏技术，如冷冻干燥或液氮冷冻等，并严格控制传代次数。
.霉菌及酵母菌验证 黑曲霉和白色念珠菌作为霉菌及酵母菌计数验证用菌株，同样需遵循生物学特性，并应用合适的保藏技术。
.需氧菌菌液制备及稀释
.细菌菌液培养 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单孢菌菌液制备，接种至10ml胰酪大豆胨液体培养基，30～35℃培养18～24小时。
.细菌稀释 取各个细菌培养液1ml分别加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10^-6~10^-7（具体稀释级需要进行验证），制成每1ml含菌数50～100cfu的菌悬液。
.霉菌及酵母菌菌液制备
.白色念珠菌培养及稀释 接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养 24～48小时；取此培养液1ml加 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 9ml。采用10倍递增稀释法，稀释至10-6~10-7，制成每1ml含菌数 50～100cfu的菌悬液
.黑曲霉孢子悬液制备 加入3～5ml 含0.05%吐温80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，使用涡旋仪将洗脱液进行混匀。准备一个无菌注射器内部塞入无菌棉球，再将洗脱液进行过滤，过滤好的菌悬液取1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法。稀释至10-4~10-6，制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液，为确保试验的准确性，所有菌液和孢子悬液的制备均需严格遵守无菌操作规程。
黑曲霉孢子悬液制作注意事项
1、黑曲霉孢子容易污染洁净环境，在进行黑曲霉孢子悬液制备时建议关闭生物安全柜风机，防止孢子扩散。
2、菌丝去除：确保去除菌丝，否则会影响后续实验。
.微生物计数方法学验证
供试液的制备
.无抑菌活性供试品 稀释剂为pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，液体供试品需与稀释剂按1:10比例混合均匀，固体、半固体、粘稠性供试品则按1:10比例混合稀释剂。
.培养基稀释法取供试液2ml，每0.2ml的供试液注一皿或每0.1ml的供试液注一皿；或取供试液1ml每0.5ml的供试液注一皿，倾注15ml的培养基，测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数。
.离心沉淀集菌法取一定量的供试液，3000转/分离心20分钟（供试液如有沉淀，先以500转/分钟离心5分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释液补至原量。
.薄膜过滤法取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，按薄膜过滤法测定其菌落数，选取适宜的中和剂如磺胺类药物加入适当的对氨基苯甲酸，含重金属的药物在培养基内加入巯基化合物。
试验组检测方法（无抑菌活性供试品为例）
无菌滤杯中，再加入1ml不大于100cfu的菌悬液过滤。最后再用300ml pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜（每次100ml，冲3次）。过滤结束后，接种金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，枯草芽孢杆菌的滤膜贴在胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）上，平行制备两份。接种白色念珠菌和黑曲霉的滤膜贴在2个胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）上和2个沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)上。
菌液组检测方法（无抑菌活性供试品为例）
取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml加入准备好滤膜的无菌滤杯中，再加入1ml不大于100cfu的菌悬液过滤。最后再用300ml pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜（每次100ml，冲3次）。过滤结束后，接种金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，枯草芽孢杆菌的滤膜贴在胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）上，平行制备两份。接种白色念珠菌和黑曲霉的滤膜贴在2个胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）上和2个沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）上。
供试品对照组及稀释级对照组检测方法（无抑菌活性供试品为例）
供试品对照组 取10ml供试液过滤，再用300mlpH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（每次100ml，冲3次），不加试验菌，操作同试验组，测供试品本底数。
稀释剂对照组（阴性对照） 用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml替代供试液，操作同试验组。
培养和计数含有铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）平板倒置于30～35℃培养箱中培养3~5天；含白色念珠菌、黑曲霉的胰酪大豆胨琼脂培养基平板（TSA）倒置于20~25℃培养箱中培养5~7天；含白色念珠菌、黑曲霉的沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）平板倒置于20～25℃培养箱中培养5~7天；供试品对照组中胰酪大豆胨琼脂培养基平板倒置于30～35℃培养箱中培养2天，观察结果后，延长培养至3 天；供试品对照组中沙氏葡萄糖琼脂培养基平板倒置于20～25℃培养箱中培养3天。 观察菌落生长情况，点计菌落数。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。
点计菌落数后，计算平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级别两个平板的菌落平均数不小于15,则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。
试验组回收率计算回收率计算试验组回收率计算的关键在于明确试验组与对照组的菌落数关系，确保数据准确；通过回收率验证，确保试验方法的可靠性和准确性，为药品微生物限度检验提供有力支持。
计数方法验证结果菌回收率计算公式：
试验组的菌回收率=
菌液对照组平均菌落数
试验组的菌回收率在(0.5～2.0),照该供试液制备方法和计数法测定供试品的需氧菌、 霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率不在(0.5～2.0)范围内，应采用 其他方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。方法适用性确认时，若采用的上述方法还存在一株或多株试验菌的回收率达不到要求，那么选择最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检查。
.控制菌验证
验证菌株信息
大肠埃希菌（Esherichia coli）【CMCC(B) 44102】
金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus）【CMCC(B)26003】
乙型付伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi B）【CMCC(B) 50094】
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）【CMCC (B) 10104】
菌株保藏要求 验证实验所用的菌株传代次数不得超过5代 （从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0 代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。
菌液制备（以大肠埃希菌为例）
菌液制备方法 取1环大肠埃希菌新鲜TSA斜面培养物接种至胰酪大豆胨液体培养基（TSB）中，30～35℃培养18～24小时。
菌液稀释制备分别取培养液 1ml加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨溶液，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5~10-7，制成每1ml含菌数10～100cfu的菌悬液。
验证过程（大肠埃希菌） 试验组：取1：10的供试液10ml加入滤杯，再加入1ml不大于100cfu的大肠埃希菌菌悬液过滤。最后再用300mlpH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜（每次100ml，冲3次）。过滤结束后，将滤膜接种至装有100mlTSB的无菌锥形瓶中。于30～35℃培养18-24h，观察结果。取上述培养物1ml 接种至100ml麦康凯液体培养基（MCB）中，42～44℃培养24小时，取麦康凯液体培养物划 线接种于麦康凯琼脂培养基（MCA）平板上30～35℃培养18小时。
菌液对照组：取10mlpH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试品，其余操作同试验组。
阴性对照组：取10mpH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试品，以稀释液代替菌液同试验组操作。
阴性对照组要求试验组、菌液对照组应检出大肠埃希菌，阴性对照组应未检出试验菌，验证试验有效，否则应消除供试品的抑菌活性重新验证。
至少应进行3次独立平行试验。阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，照该供试液制备方法和控制菌检查法进行该供试品控制菌的检查。
未检出试验菌处理若试验组未检出试验菌，应采用自然沉降法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
.再验证
药品组分变化 当药品的组分发生改变可能影响检验结果时，需要进行再验证。
检验条件调整当验证时检验条件发生改变可能影响检验结果时，需要进行再验证。
