作者：杭州惠世微生物研究中心
微生物鉴定一直是医药行业非常重要的监控指标，可以帮助预测药品生产过程尤其是无菌生产环境的风险。建立环境微生物菌种库对于药企微生物污染控制至关重要，环境微生物菌种库的建立对于洁净区消毒灭菌程序的制定，以及调查污染来源有着关键的指导意义。有效的环境微生物监控，对确保产品的卫生安全、保证产品质量和无菌检查结果的可靠性极为重要。
美国FDA要求药厂将微生物鉴定到“种”一级，并建议在微生物形态和生化反应鉴定之外采用基因分型技术进行分析，以便对生产环境中的微生物污染情况进行监控。药品生产质量管理规范（Good Manufacturing Practice，简称GMP）要求对环境、原/辅料及不同阶段的产品监控或检测到的微生物进行鉴定，并建立污染菌种库。将异常菌株与菌种库中的菌种进行比对，查找其来源，并针对菌种特性对相应的监控环境采取有效措施进行消毒。
杭州惠世微生物研究中心着眼杭州湾地区，进行环境菌的分离，建立并扩充完善环境菌菌种库信息。本文针对实验室（杭州）培养、发现的蜡样芽胞杆菌展开介绍，并对可能造成的GMP风险进行分析。
近几年，微生物控制更是FDA审计中重点关注的缺陷项，因此了解蜡样芽胞杆菌的来源、形态特征以及控制措施至关重要。在2018的一个483表中，FDA曾提出：在 2017 年9月6日，环境采样（Fingertip）显示有1个菌落形成单位（CFU）和多到无法计数（TNTC）的菌落形成单位。然而，微生物鉴定报告（Report）没有包含“TNTC”碟的结果。单个CFU被鉴定为蜡样芽孢杆菌。在最终批次放行之前，质量部门没有发现此排除TNTC菌落的情形。涉事批产品被分发，并且直至FDA 检查之前没有针对此事件启动偏差处理。涉事员工在2017年9月6日之后继续进行该药品的生产。此外，在检测到产芽孢微生物后，你们公司没有按照既定书面程序的要求进行清洁。
2023年9月22日，佛罗里达州拉戈市，维斯塔制药有限责任公司（VistaPharm LLC）主动召回一个批次的硫糖铝口服混悬液（规格为1克/10毫升），召回范围涉及消费者层面，原因是该产品受到蜡样芽孢杆菌污染。风险声明：对于免疫功能低下的高风险人群而言，口服混悬液受到微生物污染极有可能导致诸如心内膜炎和坏死性软组织感染等可危及生命的播散性感染。
在2024.10.17 FDA一份警告信提出，Japan Maruhachi Muramatsu Inc., Danchi Factory在“□□□”关键控制点，“□□□”这一关键限值不足以控制那些能在热处理后存活的产芽孢病原体（例如，蛋白水解型肉毒梭菌和蜡样芽孢杆菌）的生长及毒素形成。关键限值应规定产品“需在两小时内从57.2℃冷却至21.1℃（135°F至70°F），并在随后的四小时内从21.1℃冷却至4.4℃（70°F至40°F）”。
蜡样芽孢杆菌介绍：
蜡样芽孢杆菌（学名：Bacillus cereus），又称仙人掌杆菌，是一种革兰氏阳性菌，β溶血性的杆状细菌 。经常在土壤和食物中被发现，有些菌株会引起食物中毒，例如"炒饭综合症"（Fried Rice Syndrome）；另外一些菌株则对其他动物有益。蜡样芽孢杆菌是兼性厌氧性。与其他芽孢杆菌相同，它会产生防御性的内芽孢。它的致病因子包括施普善（Cereolysin）和磷脂酶C（Phospholipase C）。
Ø形态特征
芽胞杆菌属(Bacillus)中的一种。菌体细胞杆状，末端方，成短或长链，1.0～1.2×3.0～5.0μm。产芽孢，芽孢圆形或柱形，中生或近中生，1.0～1.5微米，孢囊无明显膨大。革兰氏阳性，无荚膜，运动。菌落大，表面粗糙，扁平，不规则。菌落形态：在普通琼脂平板培养基上，37 ℃，培养24 h，可形成圆形或近似圆形、质地软、无色素、稍有光泽的白色菌落(似蜡烛样颜色)直径5～7 mm。在M.Y.P 培养基上生长更旺盛，菌落直径达8～10 mm，质地更软，挑起来呈丝状，培养时间稍长，菌落表面呈毛玻璃状，并产生红色色素。在蛋白胨酵母膏平板上菌落为灰白色，不透明，表面较粗糙，似毛玻璃状或融蜡状，菌落较大。蜡状芽胞杆菌细菌对外界有害因子抵抗力强，分布广，是典型的菌体细胞，有部分菌株能产生肠毒素，呈杆状(约1.5μm)，有色，孢子呈椭圆形，有致呕吐型和腹泻型胃肠炎肠毒素两类。
生态习性
兼性好氧。生长温度范围20～45℃，10℃以下生长缓慢或不生长。存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。在葡萄糖肉汤中厌氧培养产酸，从阿拉伯糖、甘露醇、木糖不产酸，分解碳水化合物不产气。大多数菌株还原硝酸盐，50℃时不生长。在100℃下加热20min可被杀灭。
Ø蜡样芽孢杆菌收集
集菌方法：薄膜过滤法，准备100ml的自来水，采用亲水性小于0.22微米的滤纸进行过滤，培养基采用R2A培养基。
Ø蜡样芽孢杆菌培养
蜡样芽胞杆菌兼性好氧。生长温度范围20～45℃，10℃以下生长缓慢或不生长。将收集好的蜡样芽孢杆菌在高温30-35℃的培养箱中进行过夜培养。
Ø蜡样芽孢杆菌检测
杭州惠世微生物中心将培养好的蜡样芽孢杆菌经过处理，涂至靶板上，添加基质，用TOF进行鉴定，鉴定后的数据用数据库进行比对，确认该菌为蜡样芽孢杆菌
Ø菌种特性
蜡样芽胞杆菌的危害性较强、不易杀灭、传播途径多且容易生长的特性，可以看出其对日常的生产过程易造成影响，应该重点关注。
Ø预防措施
1.根据菌种的传播方式，分析在制药生产过程中可能产生风险的方式，并根据其特点来确认重点管控措施。
2. 结论：根据三个菌种的传播介质来看，人员是其共同且重要的传播介质，应该重点管控人员可能造成的污染。
另外，对于蜡样芽胞杆菌，FDA在2024.05.22进行问题回答时曾提到：
存放在敞口容器内的部件或产品可能面临被产芽孢微生物（比如蜡样芽孢杆菌）以及沙雷氏菌属和其他令人担忧的空气传播微生物污染的风险（可参考下文提及的美国食品药品监督管理局新闻稿和《发病率与死亡率周报》）。处于多风环境或暖通空调（HVAC）条件不佳的制造区域，可能会增加这种环境污染风险出现的可能性。部分材料，尤其是源自天然的材料，可能本身就带有较高的、让人难以接受的微生物负载量。水质会带来重大风险，因为多数消毒剂都将水作为关键成分。受污染的纯化水一直是多次消毒剂召回事件的根本原因，其中就包括消毒剂被洋葱伯克霍尔德菌（曾用名洋葱假单胞菌，Burkholderia (previously Pseudomonas) cepacia）这种机会致病菌污染的情况。不卫生的操作或源头也会引发问题。
