流式细胞术（flow cytometry）是20世纪60年代后期开始发展起来的利用流式细胞仪快速定量分析细胞群的物理化学特征以及根据这些物理化学特征精确分选细胞的新技术，主要分为流式分析和分选2部分。

今天我们主要介绍流式分析中基本操作与技巧，首先简要了解一下什么是流式细胞术。

一、流式细胞术的3大要素

1、流式细胞仪

流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置。

它由液流系统、光路系统和检测分析系统构成。

液流系统：负责细胞样本的流动和传输。

光路系统：始于激光器，并根据其发射的激光波长分类，如常见的488nm的蓝激光器、635nm的红激光器和405nm的紫激光器。这些激光器发出的激光照射到细胞后产生的光信号会经过不同的光路系统被不同的通道接收。

检测分析系统：以通道为单位将细胞的各个通道的光信号汇总分析，最后得出样品群体中细胞的物理化学特征。通道可以理解为光电倍增管，其作用包括将光信号转变为电子信号和放大电子信号。通道可以分为散射光通道（FSC通道、SSC通道）和荧光通道。

一个激光器下可以有多个荧光通道，一个通道对应多个荧光染料。例如，beckman的DXflex机器的638nm红激光器下，APC通道可以接收APC、Alexa Fluor647、eFluor660荧光信号。

2、样品细胞：

流式细胞术检测的对象一般是细胞，并且是呈独立状态的悬浮于液体中的细胞。如果要检测组织中的细胞，必须先将组织制备成单细胞悬液。

3.荧光偶联抗体：

样品细胞只有标记荧光素偶联抗体进而被激光照射后才能发射荧光信号，从而得到样品细胞表达某抗原分子强弱等情况。

二、流式细胞术的基本操作与技巧

1. 样品准备

细胞收集：从培养皿、悬浮液或组织中收集细胞。

清洗：使用适当的缓冲液（如PBS）清洗细胞，去除培养基、血清和其他杂质。

细胞计数：使用血球计数板或自动细胞计数器对细胞进行计数，以便后续实验中的标准化。

细胞固定和通透（如果需要）：对于某些分析（如细胞内蛋白质或核酸），需要对细胞进行固定和通透处理。

2. 抗体标记

选择抗体：根据实验目的选择特异性抗体。

稀释抗体：将抗体稀释到适当的浓度，以减少非特异性结合。

孵育：将细胞与抗体在适当的温度和时间内孵育，使抗体与细胞表面的抗原结合。

清洗：使用缓冲液清洗细胞，去除未结合的抗体。

3. 流式细胞仪设置

选择激光器：根据所使用的荧光标记物选择合适的激光器。

设置通道：根据实验需求设置散射光和荧光通道。

调整电压：调整各通道的电压，使信号在合适的范围内。

设置门控：使用FSC和SSC参数设置门控，以选择目标细胞群体。

4. 样品检测

上样：将标记好的细胞样品上样到流式细胞仪中。

收集数据：流式细胞仪会收集每个细胞的散射光和荧光信号，并生成数据文件。

5. 数据分析

选择软件：使用适当的流式细胞仪数据分析软件进行数据分析。

设置参数：根据实验需求设置分析参数，如门控、阈值等。

创建群体：根据实验目的创建不同的细胞群体，如阳性细胞、阴性细胞等。

统计分析：对细胞群体进行统计分析，如计算比例、平均荧光强度等。

三、注意事项

在细胞制备、培养阶段，如果该培养细胞是贴壁细胞，需用先用胰酶消化细胞，然后收集待测样品细胞，离心、洗涤、封闭后标记荧光素偶联抗体即可。

如果是胸腺、脾脏和淋巴结等外周免疫器官，主要由免疫细胞组成，制成单细胞悬液，只需直接将脏器经钢网研磨即可。

如果是实体脏器肺脏、肝脏和肿瘤组织内含有较多的结缔组织，实体脏器细胞之间一般结合紧密，所以直接研磨脏器法无法得到理想的单细胞悬液。因此，研磨前需将脏器剪碎后加入IV型胶原酶和DNA核酸内切酶消化，消化后的组织再用研磨棒直接研磨。实体脏器研磨后的单细胞悬液以实体细胞为主，如果研究目标不是实体细胞，而是脏器内浸润的免疫细胞，可以用Percoll密度梯度离心法富集免疫细胞，然后再进行流式分析。

如果是实体脏器肺脏、肝脏和肿瘤组织内含有较多的结缔组织，实体脏器细胞之间一般结合紧密，所以直接研磨脏器法无法得到理想的单细胞悬液。因此，研磨前需将脏器剪碎后加入IV型胶原酶和DNA核酸内切酶消化，消化后的组织再用研磨棒直接研磨。实体脏器研磨后的单细胞悬液以实体细胞为主，如果研究目标不是实体细胞，而是脏器内浸润的免疫细胞，可以用Percoll密度梯度离心法富集免疫细胞，然后再进行流式分析。

更多细胞知识和攻略敬请留意