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由于其可注入性、高含水量和类似软组织的力学特性，水凝胶是医疗器械开发、药物输送和组织工程的多功能材料。特别是基于聚乙二醇（PEG）的水凝胶是最受欢迎的合成生物材料之一。由于其合成性质，PEG水凝胶在力学和结构上具有高度可调性，并且具有良好的可复制性，与由多糖（如透明质酸、葡聚糖）和蛋白质（如胶原蛋白、明胶）制成的天然水凝胶不同。一般而言，PEG具有羟基末端基团，可转化为多种适用于交联和与生物分子（如促进细胞黏附和酶降解的细胞外基质拟态肽）结合的功能基团。肽功能化的PEG水凝胶广泛应用于组织工程研究。然而，PEG水凝胶也用于其他应用。例如，PEG水凝胶已用于可植入生物传感器和组织密封剂。几种获得FDA批准的原位交联组织密封剂由PEG水凝胶制成，例如Ocular Therapeutix的ReSure Ocular密封剂、Integra LifeSciences的DuraSeal Exact脊柱密封剂和Becton Dickenson的Progel胸膜密封剂。其他获得FDA批准的基于PEG水凝胶的可植入医疗器械包括AngioDynamics的BioSentry Tract密封剂（用于封闭肺活检道），HydroMARK乳腺活检部位标记物和SpaceOAR设备（用于接受前列腺癌放射治疗的患者）。尽管聚乙二醇（PEG）水凝胶通常被认为是研究生物惰性的最佳材料，但对于PEG免疫原性的担忧正在增加，其对组织工程的影响尚不清楚。

来自美国得克萨斯农工大学的Daniel L. Alge团队通过免疫化小鼠以刺激抗PEG抗体的产生，并评估骨形态发生蛋白-2（BMP-2）负载的PEG水凝胶治疗后骨缺损再生的影响。定量分析显示，PEG致敏增加了骨形成与未经处理的对照组相比，而组织学分析显示，PEG致敏在缺损部位诱导了异常多孔的骨形态，尤其在雄性中更为明显。此外，PEG致敏的小鼠接受基于PEG的治疗后，免疫细胞的招募比未经处理的对照组更多。有趣的是，接受基于PEG的治疗的未经处理的对照组也产生了抗PEG抗体。骨形成和免疫细胞招募的性别差异也是明显的。总体而言，这些发现表明抗PEG免疫反应可能影响组织工程的疗效，并强调了进一步研究的必要性。相关工作以题为“Impact of PEG sensitization on the efficacy of PEG hydrogel-mediated tissue engineering”的文章发表在2024年04月18日的国际顶级期刊《Nature Communications》。

1. 创新型研究内容

本研究评估了聚乙二醇（PEG）免疫原性对组织工程疗效的影响，特别是在骨组织工程的背景下。重要的是，本研究展示了PEG致敏增加了骨形成，并在小鼠颅骨缺损治疗中使用骨形态发生素2（BMP-2）加载的PEG水凝胶时导致骨形态学上的差异，尤其是在雄性中。本研究还展示了性别依赖的抗聚乙二醇抗体产生和免疫细胞在缺损部位的招募差异，表明存在不同的免疫反应，可能对观察到的骨形成差异有所贡献。这些发现强调了对组织工程研究中聚乙二醇免疫原性的进一步研究的必要性。

本研究概述如图1所示。针对聚乙二醇（PEG）水凝胶介导的骨组织工程治疗，本研究将基于PEG的微孔退火颗粒（MAP）水凝胶支架植入小鼠颅骨缺损中。选择MAP水凝胶是因为它们可以在组织缺损中轻松形成，并具有相互连接的微孔结构，已经证明与传统的纳米孔径PEG水凝胶相比，可以产生更优秀的组织再生效果。用于制备MAP支架的PEG水凝胶微粒通过电喷雾法合成（直径=531.88±100.44微米），其中含有细胞粘附肽CGRGDS，并与基质金属蛋白酶（MMP）可降解肽KCGPQGIAGQCK（KCGPQ）交联（图1A）。在进行颅骨缺损手术和植入基于PEG的MAP水凝胶之前，小鼠经历了为期4周的PEG免疫化方案，其中包括每周皮下注射多聚乙二醇化鲍床螺旋藻血蓝蛋白（PEG-KLH）（图1B）。本研究采用这个免疫化方案是因为先前的研究表明，PEG-KLH注射在诱导抗聚乙二醇抗体产生方面非常有效，并且与其他PEG化蛋白相比，导致更高的滴度。免疫化后，收集血浆以评估抗聚乙二醇抗体的产生情况。两周后，制造2.7毫米的颅骨缺损，并且要么留空，要么用PEG MAP水凝胶治疗，或者用含有治疗性500纳克剂量的BMP-2的PEG MAP水凝胶进行治疗（MAP+BMP-2）。植入后的3周和6周，对小鼠进行人道安乐死，收集血浆，取下颅骨组织，并分析抗聚乙二醇抗体的存在对骨生长和炎症的影响。

图1 通过在颅骨缺损模型中植入基于聚乙二醇（PEG）的MAP水凝胶，评估了PEG致敏和抗PEG抗体对基于PEG水凝胶的组织工程策略疗效的影响

本研究通过ELISA测定了所有致敏小鼠在植入前和安乐死时的抗聚乙二醇（anti-PEG）IgM和IgG滴度，范围从1:100到1:3200不等。在手术和水凝胶植入之前，几乎所有经过PEG-KLH致敏的小鼠都对抗聚乙二醇抗体呈阳性反应，只有一只雌性小鼠的滴度低于1:100，无法检测出。尽管小鼠体内存在抗聚乙二醇抗体，但植入基于PEG的MAP支架后，并未观察到PEG致敏小鼠出现不良反应。通过微CT的定性分析发现，PEG基水凝胶释放的BMP-2刺激了骨形成，并部分再生了颅骨缺损（图2）。相比未处理的空白缺损对照组，未加生长因子的水凝胶并未导致骨形成增加。这些结果符合人们对BMP-2具有成骨诱导作用的广泛认识，并且由于MAP水凝胶中缺乏其他成骨诱导信号，所以能够预料到这样的结果。

图2 PEG致敏导致PEG MAP+BMP-2治疗组中骨量增加

组织学分析进一步揭示了用BMP-2加载的MAP水凝胶治疗的小鼠骨再生差异。有趣的是，与未受伤的对侧相比，颅骨缺损周围的组织呈现出形态学差异。通常情况下，缺损部位的顶骨具有较少致密和编织的胶原结构，与缺损部位相邻的组织明显比对侧组织更厚（图3）。通过组织学观察，在PEG致敏的小鼠中明显观察到骨生长增加（图3和图4），这与µCT数据中观察到的骨体积增加一致。此外，PEG致敏小鼠缺损处的新骨总体厚度更大（图3和图4）。本研究还注意到致敏和未致敏小鼠之间胶原结构的形态学变化，特别是在雄性中，未致敏小鼠的胶原染色（Masson三色染色）呈现出深色和结构化的蓝色，表明骨组织已经成熟，而致敏小鼠的胶原染色呈现编织和较少致密的形态（图4）。通过Masson三色染色对胶原沉积进行的定量分析显示，与未致敏对照组相比，用MAP+BMP-2治疗的PEG致敏小鼠在缺损部位显示出更多的胶原沉积，并且在所有治疗组中具有最高的值（图5）。在3周时，这种增加在雄性（未致敏 vs. 致敏：26.0±4.31% vs. 43.1±5.22%）和雌性（未致敏 vs. 致敏：28.8±7.64% vs. 43.8±6.34%）的MAP+BMP-2组中是显著的。考虑到胶原是骨外基质的主要成分，这些发现与3周的µCT结果相一致。

图3 PEG MAP+BMP-2治疗组显示出在缺损部位增加的基质沉积和周围组织的形态学变化

总体而言，本研究表明PEG致敏增加了骨体积，增加了骨厚度，并且可能导致颅骨缺损处的骨重塑处于较早阶段。此外，特别是在雄性中，颅骨缺损处形成的骨骼由于PEG致敏而呈现形态学差异。具体而言，与未致敏对照组相比，其结构更为多孔（图3和图4）。大的空腔可能归因于组成MAP水凝胶的微胶束，而插入在小梁骨中的小的空腔可能是骨髓产生和新形成的骨基质中存在的脂肪细胞。此外，新形成骨骼的多孔形态是早期BMP驱动的骨形成的特征，这种高多孔性可能会影响缺损部位形成的骨骼的整体结构完整性。观察到在MAP+BMP-2处理的致敏小鼠中骨多孔性更高，也可能表明MAP水凝胶降解发生变化，这是由于致敏小鼠中渗透细胞分泌的MMP改变所致。植入的MAP水凝胶使用了一个可由MMP-1、-2、-3、-7、-8和-9降解的可降解交联剂KCGPQGIAGQCK，以允许细胞诱导的水凝胶在骨再生过程中被降解。多种细胞类型参与炎症和重塑阶段的MMP的产生，包括破骨细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和粒细胞。特别是巨噬细胞分泌大量的MMP-2，而MAP水凝胶中使用的MMP可降解交联剂对其高度敏感。有趣的是，与雌性相比，雄性小鼠具有更多的细胞（图3），这可能导致了MMP的增加产生和MAP水凝胶的降解增加，进而导致观察到的致敏雄性小鼠中大空腔的增加。

图4 与未经处理的对照组相比，PEG MAP+BMP-2治疗组中的PEG致敏导致胶原蛋白结构的无序化

图5 对缺损部位基质的定量分析支持了PEG致敏导致胶原蛋白沉积增加的结论

为阐明哪些细胞可能对观察到的差异起到作用，本研究表征了接受MAP+BMP-2处理的小鼠缺损部位内CD68和CD3阳性细胞的浸润情况。本研究对CD68进行了探究，因为巨噬细胞和破骨细胞都对该标记物呈阳性反应。这些细胞是MMP分泌的主要贡献者，这些细胞的存在增加可能会增加MAP水凝胶的降解速率，并影响骨形成。此外，有充分的文献证明，抗体结合或补体作用可以通过释放趋化性补体蛋白5a (C5a)有效地招募巨噬细胞，这在激活补体之后不久发生。在3周时，与其未致敏对照相比，CD68阳性细胞的数量呈逐渐增加的趋势，且在雄性与雌性之间也存在差异（图6A）。然而，并没有发现统计学上的显著差异。在6周时，观察到了CD68阳性细胞存在的显著差异。具体而言，与其未致敏对照相比，致敏雌性的CD68阳性细胞数量在统计学上显著增加（p = 0.0168）。此外，对于未致敏组，性别差异也观察到了，因为雄性的CD68阳性细胞存在显著高于雌性（p = 0.0163）。与其致敏对照相比，未致敏的雄性小鼠在缺损部位的CD68阳性细胞存在略微增加，但这种差异并不显著（p = 0.1773）。本研究还表征了CD3阳性细胞的存在情况，因为CD3是T细胞表面标记物。T细胞在适应性免疫中发挥关键作用，促进巨噬细胞和细胞毒性T细胞的激活，以及抗体类别转换为IgG。在3周时，致敏的影响非常显著（p = 0.0001），性别和致敏之间的交互作用参数也显著（p = 0.0367）。这个结果表明，在对致敏小鼠中对PEG水凝胶的反应中，适应性免疫的参与增加，这可以通过T细胞在抗原呈递细胞上诱导增殖的事实来解释，这种细胞活动受到抗体的补体作用的帮助。与其未致敏的雌性相比，致敏雌性在缺损部位的CD3+细胞数量显著增加（p = 0.0006），并且与其未致敏的雄性（p = 0.0455）相比，与致敏的雄性之间的差异不显著（p = 0.1645）（图6B）。同一实验组中雄性和雌性之间的差异在3周时也没有统计学上的显著性。然而，在6周时，与其未致敏的雄性相比，致敏的雄性的CD3+细胞数量显著降低（p = 0.0053），与其致敏的雌性（p = 0.0146）相比。先前的研究表明，T细胞可以促进破骨细胞的生成，尤其是CD8+ T细胞可以负调节骨愈合51。因此，致敏的雄性中CD3+细胞存在的减少表明，不同的T细胞反应可能导致观察到的骨形成差异。

图6 在接受PEG MAP+BMP-2治疗的缺损部位，免疫细胞的招募受到PEG致敏在3周和6周时间点的影响，以及生物性别在6周时间点的影响

CD3和CD68阳性细胞的存在可能与MAP+BMP-2组中抗PEG抗体的普遍性密切相关。本研究探究的两种抗PEG抗体亚型包括IgM和IgG。IgM亚型是B细胞在暴露于抗原后产生的第一种抗体亚型。它具有低亲和力、高亲和力并有效激活补体。另一方面，IgG抗体是最主要的亚型，具有高度特异性、持久性，并且由于其较小的大小可以离开血液循环并进入组织。在研究期间检测敏感小鼠中这两种亚型的可检测滴度，可以揭示对MAP+BMP-2水凝胶的适应性免疫反应的参与情况，因为在MAP水凝胶植入之前，发现敏感雄性产生的抗PEG IgM和IgG抗体比敏感雌性更多。在雄性中观察到的3周CD68阳性细胞存在增加的趋势可能与植入前更高的抗PEG滴度有关。在植入后，发现敏感雄性仍然检测到比雌性更高的抗PEG IgM抗体滴度，但在接受MAP+BMP-2处理的雌性中，50%的个体在植入后3周发生了亚型转换为IgG的现象（图7A）。IgG抗体的存在需要T细胞介导的抗体转换，这可能解释了敏感雌性中CD3+T细胞存在显著增加的情况，与雄性相比。尽管敏感的雄性和雌性均接受了MAP+BMP-2水凝胶的处理，但很明显，抗PEG反应与性别相关，并且影响炎症细胞的存在、抗体产生，最终影响PEG水凝胶介导的骨再生（图2A）。一个意外的观察是，在接受MAP+BMP-2处理的原始雄性小鼠中，植入后的6周观察到CD68和CD3阳性细胞的增加。基于这一观察，本研究对在安乐死时收集的原始小鼠的血浆进行了ELISA实验，以测试抗PEG抗体的产生情况。由于材料限制，每个处理组仅分析了三只小鼠。有趣的是，在3周时，所有接受MAP+BMP-2处理的原始雄性小鼠都产生了抗PEG IgM抗体（图7B）。接受相同处理的雌性也产生了IgM抗体，但可检测滴度明显较低。一些接受MAP或MAP+BMP-2处理的雌性在6周时也产生了IgG抗体，而在雄性中没有明显观察到，但滴度也较低。在接受MAP+BMP-2处理的雄性小鼠中观察到的高可检测滴度，高达1:6400，可能与植入部位的CD3和CD68阳性细胞数量高有关。值得注意的是，这是首次研究证明PEG水凝胶基的组织工程支架本身可以在体内诱导抗PEG抗体的形成。未来的研究应继续研究这一发现的意义。

图7 在PEG致敏的小鼠中，抗体形成持续存在，并且在将PEG水凝胶植入后，也在未经处理的小鼠中检测到了抗体

2. 总结与展望

总之，本研究是了解抗聚乙二醇（anti-PEG）抗体在基于聚乙二醇的组织工程策略中的影响的重要第一步。本研究的小鼠中抗聚乙二醇抗体滴度相对较高，与人体中报道的情况相比较高。一般人群中关于抗聚乙二醇抗体的临床研究通常报告抗聚乙二醇抗体滴度在1:80-1:10018,75的范围内。然而，本研究中报道了与小鼠相当的高抗聚乙二醇滴度，特别是在接受聚乙二醇化药物治疗的个体中。例如，接受Krystexxa（聚乙二醇化尿酸酶）治疗的患者报告了大于1:243076的抗聚乙二醇化药物抗体滴度。因此，本研究中的滴度具有临床意义，并代表了存在高风险抗聚乙二醇反应的患者。此外，最近有报道称，将聚乙二醇纳米粒子mRNA疫苗用于SARS-CoV-2可以刺激抗聚乙二醇抗体的产生，并具有增强效应。在130名个体中，辉瑞-生物NTech和Moderna COVID-19疫苗分别使IgG的抗聚乙二醇抗体均值增加了13.1倍和1.78倍，IgM的抗聚乙二醇抗体增加了68.5倍和2.64倍。考虑到这些疫苗的广泛使用，全球已接种超过十亿剂次，未来高抗聚乙二醇滴度患者的患病率可能会增加。未来的研究应该研究抗聚乙二醇滴度的效应，并确定是否存在关键阈值。此外，本研究发现的性别对聚乙二醇免疫反应的影响应该进一步研究，并且应该研究年龄的影响。最后，还应该研究聚乙二醇水凝胶的基本抗聚乙二醇反应，这些水凝胶是多种获得FDA批准的医疗器械的基础，并对其他组织工程应用中聚乙二醇水凝胶的影响进行研究。

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