求助：亲们，谁知道怎么配色啊？选抗体要注意什么呢？

提到这个问题，是不是很多小伙伴都犯难了？流式细胞是一项非常实用的技术，其特点是方便快捷，结果准确，且能成功的对目标细胞进行分选，其过程如下图所示：

实验前最需要考虑的是抗体的选择和荧光素的搭配。本期内容将会帮助您解决这个难题。

1

选择流式抗体时需要注意哪些

抗体的基本要求：

（1）清楚知道待测靶标是胞内还是胞外蛋白。

（2）严格按照样品来源选择抗体反应性，因为流式抗体基本无法进行属交叉反应。

（3）必须选择明确标注可用于流式实验的抗体，不能用普通抗体代替。

流式细胞仪的要求：

（1）了解所用的流式细胞仪有几个激光器，常见的激光器有405nm、488nm和633nm等。

（2）知道每个激光器下有几个检测通道，通道数决定一次多测多少个指标。

荧光标记的选择：

（1）如果有直标抗体，尽量选直标，因为间接标记的二抗会增加实验步骤，多次清洗可能导致细胞损失和染色准确性降低。

（2）对于弱表达靶标，尽量选择强荧光素标记抗体，如PE、APC等。

多色搭配方案：

（1）每个通道只能用一种标记，如FITC和AF488，因为它们的激发波长和发射波长相近，所以不能同时使用。

（2）尽量减少光谱重叠，以减少补偿调节的需要。

（3）对于弱靶标，可以配强荧光素标记抗体，以提高检测灵敏度。

（4）五色及以上配色建议查阅文献或咨询抗体厂商。

补偿调节：

在多色流式实验中，由于各个荧光素存在光谱重叠，需要进行补偿调节，以确保每个荧光信号的准确性。

同型对照：

（1）同型对照的目的是为了减少背景干扰，更好展现抗原与抗体的结合强度。

（2）同型对照需要选择与染色的单克隆抗体相同种属来源、相同抗体亚型、相同荧光标记的抗体

2

如何调补偿？

多色流式实验，由于各个荧光素存在光谱的重叠，因此需要进行补偿调节，下图为FITC和PE两种荧光素的光谱图，在550nm附近，两种染料存在光谱重叠。

下图为CD3，CD4的染色补偿调节过程，调补偿最简单的一个词就是：“横平竖直”，慢慢理解哦！

3

关于同型对照

定义

同型对照是一种与实验中使用的主要抗体（一抗）具有相同宿主来源、相同免疫球蛋白类别和亚类以及相同荧光标记的抗体，但不针对任何特定抗原。它用于模拟一抗的非特异性结合，以评估一抗结合信号中的背景噪声水平。

重要性

减少背景噪声：流式细胞仪检测到的信号可能包含由非特异性结合引起的背景噪声。同型对照可以帮助区分这些背景噪声和真正的特异性结合信号。

标准化：通过比较同型对照和特异性抗体的信号强度，可以对实验结果进行标准化，使不同实验之间的数据更具可比性。

优化实验条件：同型对照可以帮助确定是否需要调整实验条件（如抗体浓度、孵育时间等）以减少非特异性结合。

使用方法

选择适当的同型对照：确保选择的同型对照与实验中使用的一抗具有相同的宿主来源、免疫球蛋白类别和亚类以及荧光标记。

与一抗相同的处理方式：将同型对照与一抗以相同的方式添加到细胞样品中，并在相同的条件下孵育和洗涤。

数据分析：在流式细胞仪上分析样品时，将同型对照的信号强度与特异性抗体的信号强度进行比较。如果同型对照的信号强度很高，则可能需要重新考虑实验条件或选择其他抗体。