AbMole精研抑制剂十年，最新的科研动态不断与您分享。本期与您分享的是:环境中的BPDE通过上调lnc-HZ01/p53正反馈环路诱导人类滋养层细胞凋亡。
人类滋养层细胞的凋亡可能诱发流产。滋养细胞对环境中的BaP- 7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide（BPDE）敏感。然而，不知道BPDE是如何诱导人类滋养细胞凋亡的。在这项工作中，使用BPDE处理过的人类滋养层细胞和从复发性流产和健康对照组收集的绒毛组织来探索BPDE诱导人类滋养层细胞凋亡的内在机制。结果发现lncRNA HZ01（lnc-HZ01）可以诱导人类滋养细胞的凋亡。在机制上，lnc-HZ01通过抑制其MDM2介导的蛋白体降解来上调p53表达水平。同时，发现p53作为lnc-HZ01的转录因子，促进lnc-HZ01的转录。因此，lnc-HZ01和p53在人类滋养层细胞中组成了一个正反馈回路。在正常滋养细胞中，相对较低水平的lnc-HZ01和p53抑制了p53/caspase-3的凋亡途径，使人正常怀孕。在接触BPDE后，BPDE上调了lnc-HZ01和p53的表达水平，触发了这种正反馈回路，激活了p53/caspase-3的凋亡途径，然后诱发流产。总之，我们发现了lnc-HZ01调节BPDE诱导的人类滋养细胞凋亡的新机制，为诊断和治疗不明原因的复发性流产提供了科学依据。
Nutlin-3（Abmole，M2185，纯度>99%）是一种有效的，选择性的Mdm2(依赖环指状的泛素蛋白连接酶和p53)拮抗剂，IC50为90 nM。可稳定p53缺陷的细胞中的p73。Pifithrin-α（Abmole，M2036，纯度>99%）是一种p53抑制剂，抑制p53依赖性的p53应答基因转录。Cycloheximide（Abmole，M4879，纯度>99%）是一种蛋白生物合成(protein synthesis)的抑制剂, IC50值为532.5 nM。Cycloheximide (Naramycin A)也是一种抗真菌(antifungal)素，Cycloheximide还可抑制铁死亡(ferroptosis)并抑制自噬(autophagy)。MG132（Abmole，M1902，纯度>98%）是一种蛋白酶体抑制剂，IC50为100 nM，也抑制钙蛋白酶，IC50为1.2μM。MG132可以抑制NLRP1的活化。Chloroquine（Abmole，M9559，纯度>99%）是一种autophagy和toll-like receptors (TLRs)的抑制剂，它也是一种广泛用于治疗疟疾和类风湿性关节炎的抗疟疾和抗炎剂。
Fig. 2. Lnc-HZ01 induced human trophoblast cell apoptosis by activating p53/caspase-3 pathway.
通过用p53过表达质粒转染细胞或用其特异性激活剂Nutlin-3处理细胞来上调p53，增加了Swan 71和HTR-8/SVneo细胞中p53、caspase-3和cleaved caspase-3的表达水平（图2a）。相反，通过用不同的siRNA转染细胞或用其特异性抑制剂Pifithrin-α处理细胞来下调p53，可降低两个细胞中p53、caspase-3和裂解caspase-3的表达水平（图2a）。因此，p53对其下游的caspase-3和裂解caspase-3在人类滋养层细胞中起着积极的调节作用。此外，p53的上调增加了人滋养细胞Swan 71和HTR-8/SVneo细胞的凋亡率，而p53的下调则减少了（图2b），说明p53诱导了人滋养细胞的凋亡。总之，这些结果表明，p53/caspase-3信号通路可能促进滋养细胞的凋亡。随后，我们探讨了lnc-HZ01是否调节人类滋养细胞中的这种p53/caspase-3信号通路。我们发现，在Swan 71和HTR-8/ SVneo细胞中，lnc-HZ01的过表达或敲除并不明显影响p53和caspase-3的mRNA水平。然而，lnc-HZ01的过量表达上调了两个细胞中p53、caspase-3和裂解caspase-3的蛋白水平，而lnc-HZ01的敲除则下调了这一蛋白水平（图2c），表明lnc-HZ01在人类滋养层细胞中上调了这一p53/caspase-3途径。此外，在Swan 71和HTR-8/SVneo细胞中，用p53抑制剂Pifithrin-α处理细胞后，过表达lnc-HZ01对该途径的上调作用被逆转（图2d）。同样，用p53激活剂Nutlin-3处理这两种细胞时，沉默lnc-HZ01对该途径的下调也被逆转（图2d）。这些数据证实，lnc-HZ01上调了这一p53/caspase-3途径。此外，滋养层细胞的凋亡率也显示了一致的结果。lnc-HZ01的过量表达促进了滋养层细胞的凋亡，这种促进作用可以通过沉默p53在Swan 71和HTR-8/SVneo细胞中减弱（图2e, f）。总之，这些结果表明，lnc-HZ01通过上调人类滋养细胞的p53/caspase-3途径诱导滋养细胞凋亡。
Fig. 3. Lnc-HZ01 up-regulated p53 level by suppressing its proteasomal degradation in human trophoblast cells.
在知道lnc-HZ01上调p53/caspase-3通路后，我们接下来研究了lnc-HZ01如何上调人类滋养层细胞中p53表达水平的机制。首先，在Swan 71和HTR-8/SVneo细胞中都检测了p53蛋白的稳定性。lnc-HZ01的过量表达增强了p53蛋白的稳定性；而lnc- HZ01的敲除则降低了其在这两种滋养细胞中的稳定性（图3a），表明lnc-HZ01的沉默可能会促进滋养细胞中p53的降解。一般来说，蛋白质是通过泛素-蛋白体途径和/或自噬-溶酶体途径降解的，这可以通过用MG132或CQ（氯喹）处理细胞分别特异性地阻断。在此，我们发现lnc-HZ01的沉默促进了两种滋养层细胞的p53降解（图3b）。然而，在这两个细胞中，用MG132处理细胞（即通过抑制蛋白酶体降解），这种促进作用被消除了。然而，用CQ处理（即通过抑制自噬）并不明显影响p53的降解。因此，这些结果表明，lnc-HZ01可能通过蛋白酶体降解途径促进p53蛋白的降解。为了进一步确认p53的蛋白体降解，在人类滋养细胞中直接测定泛素化的p53（Ub-p53）的蛋白水平。lnc-HZ01的过量表达增加了细胞裂解液中的p53蛋白水平。然而，Ub-p53的水平却降低了（图3c，d）。同时，在Swan 71和HTR-8/SVneo细胞中，敲除lnc-HZ01可下调输入的p53蛋白水平，但增加了Ub-p53的水平（图3c，d）。然后，我们进一步发现，lnc-HZ01过表达会降低滋养细胞中的MDM2蛋白水平，而lnc-HZ01敲除会增加其蛋白水平（图3e），说明lnc-HZ01抑制了人类滋养细胞中MDM2的表达。随后，lnc-HZ01和MDM2在滋养层细胞中共同表达，以探索它们的共同作用。我们发现，过量表达lnc-HZ01会降低Ub-p53的水平，而在两种滋养细胞中共同表达MDM2后，这种降低会减弱（图3f，g）。另外，MDM2的过量表达增加了Ub-53的水平，这种增加被共同表达lnc-HZ01的两个滋养细胞所削弱（图3f，g）。总之，这些结果表明，lnc-HZ01可能通过抑制MDM2在人类滋养细胞中的表达水平来抑制p53蛋白体的降解。
Fig. 4. p53 was a transcription factor of lnc-HZ01 in human trophoblast cells.
接下来，我们调查了lnc-HZ01的转录在人类滋养细胞中是如何被调节的。根据PROMO的预测，我们发现p53可能与lnc-HZ01的启动子区域相互作用。为了验证这一点，使用p53的过量表达质粒或其激活剂Nutlin-3过量表达，可上调Swan 71和HTR-8/SVneo细胞中lnc-HZ01的表达水平（图4a-d）；使用其两个siRNA或其抑制剂Pifithrin-α敲除p53，可下调两个细胞中lnc-HZ01的表达水平（图4a-d）。此外，p53 ChIP检测进一步证实p53能与Swan 71和HTR-8/SVneo细胞中lnc-HZ01的启动子区域结合（图4e，f）。总之，这些结果表明，p53可能作为一个转录因子，促进人类滋养细胞中lnc-HZ01的转录。
鸣谢：Xinying Huang, et al. Ecotoxicol Environ Saf. 2022 Jun 1;237:113564.
