AbMole精研抑制剂十年，最新的科研动态不断与您分享。本期与您分享的是:天然多酚与NAD+前体和TLR2/6配体脂肽的结合可以保护小鼠免受致命的γ辐射。
引言：能够在体内对电离辐射提供长期保护的有效制剂将在医学、生物技术以及航空和太空旅行中得到应用。然而，目前，能够有效预防致命电离辐射的药物仍是一个未满足的需求。目的：研究以抗氧化潜力著称的天然多酚化合物是否可以防止电离辐射。方法:对植物源性多酚进行筛选，以确定它们对小鼠的潜在辐射防护能力，给予小鼠致命的全身γ辐射(137Cs)剂量，预计在30天内杀死50%的动物。端粒和着丝粒染色、Q-FISH和彗星法检测染色体畸变、微核形成和DNA断裂。用酶免疫测定法和超高效液相色谱-质谱联用法研究分子氧化。采用RT-PCR、western blotting和sirna诱导的基因沉默研究信号转导机制和分子间相互作用。结果:紫檀二苯乙烯(PT)和水飞蓟宾(SIL)联合使用对放射治疗效果最好，30天存活率100%，1年存活率20%。用两种潜在的放射缓解剂烟酰胺核苷(NR，一种维生素B3衍生物)和/或促纤维母细胞脂蛋白1 (FSL1，一种Toll样受体2/6激动剂)治疗后，没有延长生存期。然而，PT、SIL、NR和FSL1联合在γ-照射后1年的生存率为90%。其机制包括诱导依赖于Nrf2的细胞抗氧化防御、减少NF-kB信号、上调PGC-1α/sirtuins 1和3轴、PARP1依赖的DNA修复和刺激造血细胞恢复。连接Nrf2、sirtuin 3和SOD2的途径是辐射防护的关键。重要的是，这种组合不会干扰X射线介导的体内不同肿瘤细胞的杀伤。结论:放射性保护剂PT、SIL与减辐射剂NR、FSL1的组合可在体内对γ辐射产生长期有效的保护作用。这种策略有可能保护哺乳动物免受电离辐射的伤害。
Silibinin（Abmole，M5961，纯度为100%）是Silymarin的主要活性成分。Silibinin显着诱导非甾体抗炎药激活基因-1（NAG-1）在p53野生型和p53无效癌细胞系中的表达。Silibinin处理可降低Notch1细胞内结构域（NICD），RBP-Jκ和Hes1蛋白的表达，上调凋亡通路相关蛋白Bax，并下调Bcl2，survivin和cyclin D1。
Fig. 1 Effect of pterostilbene and silibinin on the survival of c-irradiated mice.
测定PT在不同剂量下的潜在保护作用。在60天的实验中，PT剂量显示最高存活率为100 mg PT/kg(图1A)。在小鼠存活方面，PT被发现优于天然类似物白藜芦醇(图1B)。PT比白藜芦醇具有更强的亲脂性和更高的细胞吸收潜力。由于不同多酚的组合可能导致潜在的协同作用，我们通过将PT与不同的多酚植物化学物质组合来研究这一可能性，这些多酚包括没食子酸(一种酚酸)、咖啡酸(一种羟基肉桂酸)、姜黄素(一种姜黄素)、表没食子儿茶素没食子酸酯(一种黄烷醇)、染料木素(一种异黄酮)、槲皮素(一种黄酮)、木犀草素(一种黄酮)、飞蛾素(一种花青素)和芍药素(一种查尔酮)。经过γ辐射的小鼠60天存活率最高(LD50/30)是PT和一种天然黄酮Silibinin (图1C)。我们还对PT + SIL联合治疗的长期生存率(360天实验)进行了分析，发现与药物治疗的对照组相比，PT + SIL联合治疗显著提高了生存率(图1D)。胃肠道和造血损伤是第一阶段死亡的原因。30 ~ 60天的死亡主要反映了动物无法克服骨髓损伤。然而，根据死后病理学的研究，多酚处理组的小鼠死于多种原因:25%(在辐照后的前60天内)死于造血损伤;50%(辐照后60-360天)由于髓系白血病、肺癌、感染/炎症或肾病(所有反映辐射诱导损伤的长期后果)。如果在照射前给予PT + SIL两种多酚，则由PT + SIL诱导的放射保护作用导致的存活率更高。此外，如图1E所示，PT + SIL治疗最小化了体重损失，这是与放疗相关的常见副作用，可能影响恢复和生存。
Fig. 2. Combination of polyphenols with potential radiomitigators (nicotinamide riboside and fifibroblast-stimulating lipopeptide 1) further increases the survival ofcirradiated mice.
对γ照射小鼠(LD50/30)照射后给予NR和/或FSL1(两种潜在的放射缓解剂)并不能显著降低死亡率(图2A)。然而，PT+SIL和NR+FSL1的组合显著提高了长期生存率(γ-照射后360天)高达90%(图2B)。PT+SIL+NR组(60%)或PT+SIL+FSL1组(50%)的1年生存率也高于对照(0%)(图2B)。如方案中所示(图2B)，两种多酚均给予1周(照射前5天，照射后2天)。基于这些多酚在使用剂量下的生物利用度，这段时间(辐照前5天)确保了抗氧化防御的最大可能效果。照射后，我们决定维持给药2天，以确保抗氧化防御保持过表达。这对于减少非辐照源性ROS是很重要的，这可能是辐射引起的组织损伤和应激的结果。我们没有延长多酚的给药超过一周，以避免任何可能的副作用在给药剂量。对于TLR2/6配体脂肽FSL1，遵循Kurkjian等人推荐的方案。单剂量在照射后一天进行。烟酰胺核苷(NR)的使用时间较长(一个月)。这是基于三个原则:a) NR引起的血液NAD+的增加是有限的(图2C)，因此，有益的效果需要更长的给药时间;b)保持细胞内高水平的NAD+(与对照组相比)有利于DNA修复，也限制了随着时间发展的突变的出现;和c)长期补充NR耐受性良好，可提高NAD+。此外，通过血液学、临床化学和分离CD2 +淋巴细胞的代谢相关参数，对体内γ辐射诱导毒性的研究表明，完全治疗也改善了电离辐射影响的所有参数。这些数据支持所应用协议的安全性。此外，为了补充发现，辐射防护组合的效果在两个典型的辐射敏感组织中进行了测试。图2C显示了在两个不同时间点(PT、SIL和NR的给药情况见图2B)，治疗小鼠和辐照小鼠循环血液中测定的PT、SIL和NAD+水平。无论是照射后第0天还是照射后第2天，PT和SIL水平在30分钟时高于120分钟时(图2C)。而NAD+水平在照射后3天或15天以及NR给药后的两个时间点相似(图2C)。
Fig. 3. Protective effect of pterostilbene and silibinin on thec-radiation-induced oxidative and cytogenetic damage.
如图3A所示，PT和SIL给药显著降低了从对照和治疗小鼠分离的3种不同细胞类型中γ辐射诱导的氧化应激相关分子标记的增加。PT + SIL降低了γ射线诱导的DNA(8-羟基-20脱氧鸟苷)、蛋白质(蛋白质羰基)和脂质(异前列腺素)的氧化损伤。PT + SIL也能维持较高的谷胱甘肽水平(一种常见的非蛋白硫醇和抗氧化剂)(图3C)。此外，PT + SIL还阻止了几个关键的氧化应激相关酶活性的下降:GCL, GPX, CAT, SOD1和SOD2(图3C-E)。此外，在未治疗和治疗小鼠中测定的抗氧化酶活性与其基因表达水平相关(图3B)。因此，这表明多酚的辐射保护作用与其调节生物抗氧化反应的能力密切相关。因此，多酚诱导的抗氧化防御上调将抵消辐射诱导的氧化应激的影响，从而防止氧化分子损伤。此外，如图3F所示，PT + SIL还降低了循环CD2+淋巴细胞中γ辐射诱导的染色体畸变和微核形成，这两者都是广泛用于监测电离辐射暴露的细胞遗传学生物指标。图3中显示的所有参数均在照射后2天测量。然而，同时给药PT + SIL + NR + FSL1并没有显著改变图3中所示的任何结果。
Fig. 4. Effect of radioprotectors and radiomitigators on cellular NAD+ content, DNA damage, and hematopoietic recovery in c-irradiated mice.
如图4A所示，NR处理增加了不同细胞类型中NAD+的含量，也防止了γ辐射引起的NAD+的下降。单独给药PT +SIL不会影响任何研究细胞中的NAD+水平，也不会影响NR引起的NAD+水平的升高。FK866是一种特殊的烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)非竞争性抑制剂，在PT + SIL + NR或PT + SIL + NR + γ射线治疗的小鼠中，FK866降低了NAD+水平(图4A)。FK866诱导的NAD +耗损与NAMPT活性的急剧下降相关(图4B) (PT、SIL、NR、FSL1和/或γ辐射不影响FK866诱导的NAMPT活性抑制率，未显示)。重要的是，如图4C所示，使用DNA损伤彗星试验，PT + SIL或NR有利于DNA恢复，它们的组合是最有效的(图4C)。推测，多酚的作用是一种抗氧化剂相关机制，而NR诱导的NAD+水平的增加直接促进DNA修复活性。如图4D所示，FSL-1增加了造血集落形成细胞CFU-GM(集落形成单位-粒细胞，巨噬细胞)和CFU-GEMM(集落形成单位-粒细胞，红系，巨噬细胞，巨核细胞)。
Fig. 5. Effect of the treatment with pterostilbene and silibinin on Nrf2-, NF-kB-, PARP1- and PGC1a-dependent mechanisms.
如图5A所示，与对照相比，PT和SIL都增加了核Nrf2，而降低了核NF-kB水平。在Nrf2的情况下，PT的作用比SIL更明显。总的来说，这些作用表明在促进抗氧化防御的同时下调NF-κb依赖的促炎反应的协同作用。PT也增加了pPGC-1α(图5A)。PT也增加了Sirt1水平。有趣的是，尽管SIL单独不影响Sirt1水平，但两种多酚的结合比单独PT增加了更多的Sirt1水平(图5A)。PT和SIL都增加了Sirt3水平，尽管SIL对Sirt3的影响更强(图5A)。PT和SIL均增加PARP1(图5A)。重要的是，除了在体内处理NR和/或FSL1(如图2B所示)外，图5A中报道的任何数据都没有显著改变，这表明所使用的两种减辐射剂都不会干扰PT和SIL组合所产生的辐射保护作用。图5B概述了这些信号级联之间可能的分子相互关系，以及PT和SIL可能发挥作用的步骤。为了进一步研究哪些特定分子可能参与了辐射防护作用，我们对分离的IECs使用了基于基因沉默的方法。如图5C所示，靶向小鼠Nfkbie(编码NFKB Inhibitor Epsilon，通过REL蛋白的细胞质保留抑制NF -κb导向的转激活)、Nfe2l2(编码Nrf2)、Ppargc1(编码PGC-1α)、Sirt1、Sirt3、Parp1、SOD2、GPX1或PRDX2基因表达的sirna促进了游离NF-κb的增加(作为其抑制剂下调的结果)和所有其他分子靶标的下调。PRDX2被纳入我们的分析，因为这种特定的酶已被证明在中和电离辐射诱导的氧化应激中发挥保护作用。分离的IECs在PT (20 lM) + SIL (15 lM)的存在或不存在的情况下培养24小时，模拟体内诱导的放射防护防御。如图5D和S4所示，PT和SIL显著降低了对照(载药处理)细胞中γ辐射诱导的细胞死亡。根据γ射线作用下细胞中特定RNA的作用，细胞死亡分析显示，多酚处理引起的辐射防护作用主要由Nrf2、pPGC-1a、SOD2和Sirt3负责(图5D)。
鸣谢：Elena Obrador, et al. J Adv Res. 2022 May 13;S2090-1232(22)00117-5.
