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由于严重损伤、癌症切除和肌肉萎缩等因素，体积性肌肉损失(VML)对临床治疗构成了重大挑战。这些情况削弱了身体固有的自愈能力，导致肌肉功能丧失。尽管已经广泛开展了几项针对VML的临床试验，但由于供体部位的限制和功能缺陷，传统的临床方法受到限制。
近日，来自韩国成均馆大学的GeunHyung Kim团队研究了通过3D生物打印技术和原位刀片涂布过程集成来增强人类脂肪来源干细胞的肌肉分化。研究表明，通过精心选择的打印参数，刀片辅助生物打印可以增强体外的肌源性活性。此外，通过在小鼠体内评估，发现剪切诱导的生物构建物能有效地恢复失去的功能和肌肉体积。这些结果显示，将生物3D打印与基于hASC的治疗策略结合，有助于增强肌肉再生和功能恢复，为未来体积性肌肉丧失(VML)的组织工程方法提供了一个有意义的平台。
相关研究成果以“Enhanced Myogenic Differentiation of Human Adipose-Derived Stem Cells via Integration of 3D Bioprinting and In Situ Shear-Based Blade Coating”为题于2024年10月18日发表在《Advanced Functional Materials》上。
为了对富含hASC的胶原蛋白生物墨水（4 wt.% 胶原蛋白）施加原位机械刺激（剪切应力），作者设计了一种基于挤压的生物3D打印工艺，并辅以刀片涂层系统（BC-生物打印）（图1A）。通过调节刀片的移动速度、刀片与打印台之间的间隙、剪切速率和其他工艺参数，可以精确控制细胞结构，包括成肌活动和细胞结构内的分化。刀片在挤出的生物墨水上的移动会产生应力梯度，导致胶原纤维变形和重组（图1B）。当刀片施加剪切应力时，生物墨水内会产生不同的流速。这些不同的剪切力会影响随机分布的胶原分子和细胞，导致它们伸长并重新调整方向，从而形成更平行、更有序的排列。使用BC生物打印工艺打印生物墨水后，使用镊子折叠细胞结构以获得体积3D细胞结构（图1C）。最后，为了评估使用刀片辅助工艺制造的hASCladen生物结构作为VML治疗方法的有效性，将它们植入VML小鼠胫骨前肌缺损部位（图1D）。
图1 示意图阐明了基于刀片的原位机械刺激辅助生物打印过程，用于hASCs负载胶原蛋白结构
1.基于剪切的刀片处理条件对细胞构建体中hASC的各种细胞活性的影响
作者研究了剪切基刀片处理条件对载有hASCs的细胞构建体各种细胞活动的影响。通过调整刀片打印过程中的剪切应力（τ）或刀片至打印平台（B-T-P, Ho）距离，发现这些参数显著影响细胞构建体中的细胞活性。使用适当的剪切应力，可以诱导胶原纤维和细胞沿厚度方向均匀排列，而不当的剪切应力则可能导致细胞损伤或减少机械转导效应（图2A）。为了测定生物墨水中的剪切应力，进行了流变测量，并使用功率定律模型估计了打印过程中的应用剪切应力。通过调整刀片移动速度、刀片与打印台之间的间隙、剪切速率等过程参数，可以精确控制细胞结构在肌源性活动和分化方面的表现。这些操作导致在生物墨水中产生不同的剪切力，影响胶原分子和细胞的排列，从而实现更有序的排列（图2B）。
通过免疫荧光成像，观察了在不同剪切应力下hASCs的PIEZO-1表达和F-actin发展，结果显示随着剪切应力的增加，PIEZO-1的表达和F-actin的形成均有所增强。然而，应用过高的剪切应力（192 Pa）时，由于细胞存活率较低，PIEZO-1表达和F-actin形成均有所下降（图2D-F）。这些结果表明，适当的剪切应力可以有效促进细胞机械转导信号的激活，进而增强细胞的肌源性分化。此外，通过对不同剪切应力下细胞的核定向频率进行分析，发现在低剪切应力范围（94-132 Pa）中，细胞构建体顶部和底部的细胞排列存在显著差异，这表明在厚度方向上应力分布不均（图2G）。当剪切应力在137-192 Pa范围内时，顶部和底部区域的细胞排列较为均匀，显示出更优的组织工程结构。综上所述，通过精确控制剪切基刀片打印过程中的剪切应力，可以有效调节hASCs在细胞构建体中的排列和机械转导信号激活，进而促进肌源性分化。
图2 选择适合BC生物打印的剪切应力
2.载有hASC的生物结构的体外细胞反应和成肌能力
接着,作者进一步研究了在体外条件下，通过剪切基刀片处理条件制备的hASCs载体生物构建体的细胞反应和肌源性能力。研究使用了特定的剪切应力（151 Pa）和其他优化的生物打印参数来生产这些构建体，并将这些构建体（Exp）与常规生物打印方法（Con）生产的构建体进行了比较（图3A）。在Exp构建体中，由于剪切力的作用，hASCs显示出显著的细胞排列和增强的肌源性基因表达。这些构建体在肌源性介质中培养后，显示出较高的肌细胞分化和成熟，通过免疫荧光染色观察到显著的肌重链（MHC）和层粘连蛋白（Laminin）表达增加（图3B）。实验结果显示，与常规打印构建体相比，经剪切力处理的构建体在细胞存活率、肌细胞分化能力和机械特性方面具有显著优势。这些构建体的肌肉组织在力学性能测试中表现出较高的弹性模量，这表明它们具有较强的结构完整性和功能潜力（图3C）。
经剪切基处理的生物构建体（Exp）在细胞活性和机械刺激响应方面表现出了较常规生物打印构建体（Con）更优的表现。Exp构建体中hASCs的排列更为一致且表达了更多的肌源性和机械转导相关基因，如PIEZO-1和vinculin，显示了其在接受机械刺激后的积极响应（图3D-E）。进一步的基因表达分析揭示了Exp构建体中肌源性分化相关途径的激活，包括FAK和多种信号通路，如PI3K/AKT和MAPK路径。这些通路的激活促进了细胞的增殖、细胞骨架的形成和细胞外基质的合成，从而增强了肌源性分化的效率和质量（图3F-G）。
图3 BC生物打印hASC的体外细胞反应
3.经剪应力处理的hASC的成肌能力
通过在肌源性培养基中培养经剪切处理的hASCs载体构建体（Exp），与常规打印的对照组（Con）相比，Exp组展示出更加优越的肌源性分化潜力。首先，作者通过免疫荧光成像观察了Exp和Con构建体中的肌重链（MHC）和层粘连蛋白（Laminin）的表达。结果显示，Exp组中MHC和Laminin的表达显著高于Con组，表明剪切应力处理促进了肌源性分化和基底膜的形成（图4A）。对Exp和Con构建体的肌肉结构进行了进一步分析表明经剪切应力处理的构建体在培养过程中形成了更多的成熟肌纤维（图4B）。此外，Exp组的肌纤维在构建体中的排列更为一致，显示出较高的定向因子，这进一步证明了剪切应力的正面效应（图4C）。通过测定Exp和Con构建体在不同培养时间点的肌源性相关基因的表达，发现Exp组的相关基因表达水平在整个培养过程中持续上升，而Con组的增长较为缓慢。这一结果进一步验证了剪切应力处理对促进hASCs肌源性分化的有效性（图4E,-F）。通过实验分析，证实了剪切应力处理可以显著提升hASCs的肌源性能力。
图4 BC生物打印生物结构中hASC的体外肌生成
4.体内骨骼肌修复评估
基于以上结果，作者最后评估了经剪切应力处理的hASCs生物构建体（Exp）在小鼠体内的骨骼肌修复能力，并与常规生物打印构建体（Con）进行比较。作者首先在小鼠体内建立了体积性肌肉丧失（VML）模型，并将Exp和Con构建体植入受损的胫前肌。四周后，观察和评估了这些构建体对肌肉结构的重建和功能恢复的影响。结果表明，Exp组的小鼠在肌肉质量、握力和悬挂测试的延迟时间上都显著优于Con组和VML对照组，说明剪切应力处理的构建体在恢复肌肉功能和体积方面更为有效（图5A-E）。通过组织学染色对植入后的肌肉组织进行了分析。Exp组显示出更高的肌纤维直径、更多的周边核心肌纤维，并且纤维组织的成熟度和组织结构的整体质量都优于Con组和VML对照组。这些结果进一步证明了Exp构建体在促进肌肉组织再生和减少纤维化方面的潜力（图5H-I）。
图5 小鼠VML模型中生物结构的肌肉功能和组织学评估
最后，通过免疫化学染色分析了肌肉组织中的肌重链（MHC）、人类特异性抗原（HLA）、线粒体核糖体蛋白L11（MRPL11）和CD31的表达，以评估肌肉纤维的形成和血管化。Exp组在MHC和人类特异性标记物的表达上均高于Con组，显示出更好的肌纤维生成和血管形成，这支持了其在生物构建体与宿主组织整合和功能恢复方面的效果（图6）。
图6 体内机械刺激生物结构的肌纤维形成和血管化
综上，本文通过增强生物3D打印技术并辅以刀片铸造来创建具有独特生物物理提示的载细胞结构，以用于肌肉再生，从而解决了与传统生物打印方法相关的挑战。研究结果表明嵌入胶原生物墨水的hASC的排列和分化增强。通过优化打印参数，在体外实现了有效的细胞排列和增强的成肌活性。对小鼠体内VML缺陷的研究表明，使用开发的基于剪切的生物打印系统处理的生物结构可以有效恢复丢失的功能和肌肉体积。这些发现凸显了将先进的生物打印技术与基于干细胞的疗法相结合以改善VML患者的肌肉再生和功能恢复的潜力，为未来VML治疗的组织工程方法的进步带来了希望。
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