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功能性注射蛋白水凝胶的开发和应用为微创手术下的组织再生提供了一种策略。作为软骨细胞外基质的重要成分，胶原蛋白作为干细胞修复软骨的最佳生物仿生细胞外基质（ECM）之一被广泛应用。然而，从动物身上提取的胶原蛋白存在一些缺点，如机械稳定性不足、降解速度快以及潜在的免疫原性。尽管一些胶原蛋白衍生物（水解蛋白、肽和重组人胶原蛋白）因其免疫原性相对较低而被广泛研究，但其机械强度和生物学性能不足的问题仍有待解决。因此，开发具有高强度和令人满意的生物性能的新型可注射水凝胶以帮助软骨原位再生至关重要。低聚肽和多肽分子的组装可以通过分子间相互作用重建各种有序的高级结构，从而实现类似蛋白质的生物功能。
来自四川大学的孙勇团队开发了一种受“分子魔术贴”启发的多肽与明胶共组装策略，即通过分子内/分子间相互作用将两亲性超分子三肽连接到明胶甲基丙烯酰分子链上。本研究进行了分子对接和动力学模拟，证明了这一策略的可行性，并揭示了共组装水凝胶的高级结构转变，它带来了更有序的β片含量和 10 倍以上的抗压强度提高。本研究进行了转录组分析，揭示了共组装水凝胶在促进细胞增殖和软骨分化中的作用。皮下植入评估证实，与 I 型胶原相比，水凝胶的炎症反应和免疫原性大大降低。本研究证明，骨间充质干细胞负载的共组装水凝胶可通过光固化稳定固定在兔膝关节缺损处，三个月后可显著促进透明软骨再生。这种共组装策略为开发软骨再生生物材料提供了一种方法。相关工作以题为“Molecular co-assembled strategy tuning protein conformation for cartilage regeneration”的文章发表在2024年02月19日的国际顶级期刊《Nature Communications》。
1. 创新型研究内容
本研究受 “魔术贴”物理粘附性的启发，采用 BPAA-GFF 分子作为“分子魔术贴”，通过氨基酸间潜在的氢键和亲水/疏水相互作用，粘附到明胶甲基丙烯酰（GelMA）的氨基酸序列上。同时，在明胶中引入甲基丙烯酸，使其具有原位成形和界面键合能力，并进一步提高机械强度。分子对接和分子动力学模拟证实了共组装水凝胶的分子机理。转录组分析表明，共组装纤维水凝胶促进了干细胞的增殖和分化，以及特异性基质的分泌。含有BMSCs的共组装水凝胶可使兔关节软骨缺损处的透明软骨再生，证明了其在临床软骨再生生物材料中的潜在用途（图1）。
图1 用于构建可注射的纤维状蛋白水凝胶以促进软骨原位再生的魔术贴启发的蛋白肽共组装策略示意图
【共组装水凝胶的构建与优化】
首先，本研究制备了取代度为76.74%的GelMA和BPAA-GFF，并实现了水凝胶的共组装（图2a）。分子对接通过估计分子的空间和能量匹配来预测结合亲和力，从而验证了“分子魔术贴”（BPAA-GFF）通过分子间相互作用粘附到 GelMA 上的假设。分子对接观察到的粗略和详细结合位点表明，BPAA-GFF与GelMA之间的连接是由分子间相互作用驱动的，尤其是氢键（H-bonds）、Pi-阳离子相互作用等（图2b-d）。为了优化分子共组装体系的组成和结构，本研究制备了三种不同 BPAA-GFF 含量的共组装水凝胶（Gel-co-LGFF、Gel-co-MGFF 和 Gel-co-HGFF）。随着 BPAA-GFF 含量的增加，注射力和压缩模量都有所提高（图 2e）。令人惊讶的是，Gel-co-HGFF 的压缩模量是 GelMA 的 14 倍（图 2f）。这些改进可能归因于分子内或分子间相互作用的改变和结构转变。
图2 共组装水凝胶的设计、制备和表征
【通过分子间相互作用实现分子共组装水凝胶的结构转变】
为了在微观尺度上观察Gel-co-MGFF的结构变化，本研究探究了引入BPAA-GFF后GelMA的结构摆动。在共组装过程中，Gel-co-MGFF结构变得更加紧凑，这是因为BPAA-GFF作为 “分子魔术贴”与内部蛋白链结合，并与GelMA的不同区域相互作用（图3a）。与 GelMA 相比，Gel-co-MGFF 的回转半径（Rg）、均方根偏差（RMSD）、溶剂可及表面积（SASA）和均方根波动（RMSF）值较低，这也证实了 Gel-co-MGFF 的结构更紧凑，稳定性更高（图 3b-e）。为了说明结构和性能优化的原因，本研究比较了 GelMA 和 Gel-co-MGFF 的相互作用。结构和稳定性的改善来自于更多的分子间相互作用，如 H 键、盐桥、Pi-Pi 堆积和 Pi-阳离子（图 3f1、f2）。在这些相互作用中，H 键在 BPAA-GFF 与 GelMA 的相互作用中起着关键作用，可能是共组装过程的主要驱动力（图 3f3）。此外，二级结构的比例也随着相互作用次数的增加而发生变化。与 GelMA 相比，Gel-co-MGFF 显示出更多的β片状结构，而其他二级结构含量较少（图 3g）。
图3 分子间相互作用导致了共组装水凝胶的高级结构转变
【Gel-co-MGFF 调节 BMSCs 的生物学机制】
转录组分析用于研究潜在的生物学机制。皮尔逊相关分析（图 4a）表明，两组内生物重复之间存在良好的相关性。在 Gel-co-MGFF 与 GelMA 的对比中，火山图显示有 326 个上调基因和 221 个下调基因（图 4b）。本研究还通过基因本体（GO）通路对差异表达基因进行了分析。在 GO 数据库分析中，Gel-co-MGFF 与 GelMA 相比，上调基因主要集中在细胞粘附、生物粘附和细胞-细胞信号传导基因，以及细胞外区域、胶原三聚体和转运体活性（图 4c）。同时，下调的基因主要涉及蛋白水解、氧化还原过程和丝氨酸水解酶活性等（图 4d）。相关的上调-KEGG通路表明，Gel-co-MGFF增强了细胞粘附和增殖（病灶粘附、PI3K-Akt信号通路）以及基质形成（ECM-受体相互作用、糖胺聚糖生物合成-硫酸肝素/肝素）（图4e）。特定的基因热图及其相应的蛋白-蛋白相互作用网络阐明了 GO 和 KEGG 分析中相关的上调或下调基因，包括上调的胶原蛋白 II（Col II）和下调的基质金属蛋白酶 13（Mmp-13）（图 4f，g）。转录组分析表明，Gel-co-MGFF 有可能与整合素家族受体结合，促进 BMSCs 粘附，然后通过局灶粘附、PI3K-Akt 信号传导途径促进 ECM-受体相互作用、细胞增殖和软骨分化（图 4h）。
图4 转录组分析揭示了共组装水凝胶对 BMSCs 行为的调节作用
【含有 BMSC 的Gel-co-MGFF的软骨分化】
为了研究 Gel-co-MGFF 驱动的 BMSCs 软骨分化并证实转录组分析的结果，本研究评估了软骨相关基因的表达和软骨相关基质的分泌。免疫荧光（IF）染色和半定量分析显示，与 GelMA 相比，Gel-co-MGFF 能促进 BMSCs 分泌更多的胶原蛋白 II（Col II）和 SRY-box 转录因子 9（Sox9），而胶原蛋白 I（Col I）和胶原蛋白 X（Col X）却大大减少了，这表明 Gel-co-MGFF 构建了更适合 BMSC 软骨分化的微环境（图 5a，b1-b4）。此外，Gel-co-MGFF 中更多的糖胺聚糖（GAG）分泌和更少的 Mmp-13 表达也验证了其对透明软骨基质维持的作用（图 5c，d）。此外，较高的 Aggrecan（Agg）和 Col II 表达以及较低的 Col I 和 Col X 表达表明，Gel-co-MGFF 有能力促进 BMSCs 的软骨分化，并有可能抑制软骨纤维化和肥大（图 5e，f）。
图5 Gel-co-MGFF 促进 BMSC 软骨分化
【异位软骨生成和体内免疫反应】
异位软骨生成通常被用作评估软骨再生潜力的关键指标。将含有 BMSC 的 Gel-co-MGFF 或含有 BMSC 的 GelMA 皮下植入裸鼠体内（图 6a）。植入 30 天后，较高的 GAG 与总 DNA 比率表明 Gel-co-MGFF 促进了软骨基质的形成和维持（图 6b）。定量聚合酶链反应（q-PCR）和 IF 染色都证明了 Gel-co-MGFF 对维持透明软骨表型的作用（图 6c-e）。众所周知，较低的免疫原性和适当的炎症反应可加速组织再生。因此，有必要评估 Gel-co-MGFF 诱导的免疫原性和炎症反应。IF 染色和半定量分析显示，GelMA 和 Gel-co-MGFF 中成熟 B 淋巴细胞和免疫球蛋白 G（IgG）分泌较少（图 6f 和 5g），表明这两种水凝胶的免疫原性低于动物源 I 型胶原。此外，较高的 CD206+ 表达（M2 巨噬细胞）和较低的 CD86+ 表达（M1 巨噬细胞）表明，与 GelMA 相比，Gel-co-MGFF 产生的炎症反应较低（图 6h，i）。
图6 异位软骨生成和体内免疫反应
【在兔子模型中利用含有 BMSC 的凝胶-co-MGFF 重建软骨】
本研究在兔子全厚软骨缺损模型（直径 3 毫米）中系统评估了 Gel-co-MGFF 对关节软骨再生的影响。将含有 BMSC 的水凝胶注入关节软骨缺损区，然后用蓝光照射使水凝胶原位交联。三个月后，Gel-co-MGFF 组的缺损几乎完全被再生软骨填满，而且 Gel-co-MGFF 的国际软骨修复协会（ICRS）评分高于 GelMA（图 7a-c）。Gel-co-MGFF 组的软骨厚度和胶原纤维方向与正常组相似（图 7d-f）。Masson's trichrome（MT）染色和 Safranin O-Fast green（SO-FG）染色显示，Gel-co-MGFF 有更多的胶原蛋白和蛋白多糖分泌（图 7g-i）。然而，空白组在三个月后出现了明显的缺陷。细胞和胶原纤维的无序排列以及有限的 ECM 分泌也证实了空白组软骨再生效果不佳，这与之前的文献结果一致。与 GelMA 相比，更多的蛋白多糖 4（Prg4）分泌说明了 Gel-co-MGFF 对减少软骨摩擦的作用（图 7j，k）。Col II的高表达以及Col I和Col X的低分泌证实了负载BMSCs的Gel-co-MGFF在体内促进透明软骨再生、抑制软骨纤维化和肥大的能力。此外，Mmp-13 的分泌减少也证实了 Gel-co-MGFF 在软骨基质维护方面的生物功能得到了改善（图 7l-s）。
图7 含 BMSCs 的凝胶-co-MGFF 在兔模型中再生透明软骨
2. 总结与展望
总之，作为一种“分子魔术贴”，BPAA-GFF分子重构了紫外固化明胶长链的空间构象，从而形成了一种具有更先进生物功能的稳定的共组装蛋白质水凝胶。超分子短肽纤维推动向更有序的β-片构象转变，使共组装系统形成更紧凑的纤维状结构，从而大大提高了蛋白质凝胶的机械强度（10 倍或更多）。体外和体内生物评估证实，Gel-co-MGFF 可通过促进细胞增殖和基质维护来促进软骨再生。这种“分子魔术贴”概念为开发用于软骨再生的高强度可注射蛋白质凝胶提供了一种全新的策略。
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