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作为一种有效的细胞组装方法，3D生物打印技术在过去十年中被广泛应用于构建器官模型和组织修复。然而，在整个打印过程中产生的不同剪切应力会对细胞的完整性产生复杂的影响，包括降低细胞活力、引发形态变化和改变细胞功能。目前还不清楚可能出现的潜在影响以及这些影响的表现条件。
来自浙江大学的贺永团队和来自澳大利亚新南威尔士大学的Tracie Barber团队合作系统性地综述了不同哺乳动物细胞在剪切应力下的反应。本研究列举了现有的实验装置，并对不同应力模式下可能受到影响的特性进行了分类。本研究还总结了细胞损伤数学模型，作为设计生物打印系统的预测参考。本研究的主要结论是，必须量化细胞对剪切应力的具体抵抗力，以优化生物打印系统。此外，由于剪切应力可产生大量积极影响，包括诱导细胞排列和促进细胞运动，本研究建议在开发未来系统时找到适当的剪切应力范围并积极利用其积极影响。相关工作以题为“Hydrodynamic shear stress' impact on mammalian cell properties and its applications in 3D bioprinting”的综述文章发表在2024年02月15日的国际知名期刊《Biofabrication》。
【3D生物打印与更好的液滴性能和细胞完整性之间的两难选择】
3D生物打印是普通3D打印技术的一种应用和发展，用含有细胞的水凝胶代替油墨，是生命科学和医学领域的一项新兴技术。3D生物打印技术保留了3D打印技术逐层生成高精度、高分辨率结构的特点，同时为异质组织构建提供了巨大潜力，甚至可以制造不同类型的细胞。该技术已初步应用于组织工程，打印出结构简单的组织，包括软骨、血管和皮肤，用于重建或替代。它也被认为是一种高效的生物制造技术，可用于药物开发，制造出具有更好生物仿真特性的3D肿瘤模型，用于药物筛选。
一般来说，有三种常见的生物打印技术--喷墨打印、微挤压打印和激光辅助打印（图 1(A)）。这些技术可根据不同的喷点方法进一步分类。在微挤压生物打印中，生物材料通过活塞或螺杆机械挤出，或通过气动压出。在喷墨生物打印中，利用加热或压电元件引起的变形将材料液滴从打印喷嘴中喷出。这些狭窄的收缩可能会产生巨大的流体动力应力，从而损害细胞的活力。但另一方面，喷嘴尺寸越小，分配精度就越高。因此，挤压打印点胶精度的提高在很大程度上受到限制。如今，挤压打印的精度仍不低于 100 微米，与 20 年前的技术相同。提高打印分辨率的典型方法包括缩小喷嘴尺寸和增加生物墨水粘度。但无论哪种方法，都会增加细胞通过喷嘴时所承受的流体动力应力水平。
图1 3D生物打印机分类以及打印过程的剪切应力和延伸应力
【生物打印中出现的水动力剪切应力】
众所周知，流体动力应力对细胞的各种特性有着深远的影响，包括活力丧失、表型改变以及增殖和分化性能异常。由于保持细胞完整性是3D生物打印的一个基本方面，因此定量了解细胞如何应对流体动力应力对于进一步提高打印性能至关重要。
在生物打印过程中，流体动力剪切应力和延伸应力是两种被认为不利于细胞完整性的流体动力应力。流体动力剪切应力是发生在低雷诺数流动中的粘性应力，由不同流体层之间的速度不一致引起。相反，延伸应力是一种惯性主导应力，通常是由于横截面积突然收缩导致速度突然增加而引起的。在生物打印过程中，当细胞播种的生物材料被混合并输送到打印喷嘴时，会产生低水平的剪切应力；高水平的剪切应力会在狭窄的打印喷嘴内累积；此外，低水平的剪切应力在打印后的细胞/类器官培养阶段也起着重要作用。喷头横截面积的突然变化可诱发延伸应力（图 1(B)），或者，如果喷头系统产生气泡，在气泡破裂处也会产生延伸应力。当受到机械刺激时，细胞可以感知并做出相应的反应。细胞膜上有许多机械传导信号通路，包括瞬态受体电位通道和压电通道，其中压电通道等机械敏感离子通道会在细胞膜经历张力变化时被激活。激活的机械敏感通道反过来又会启动阳离子流入，从而扰乱细胞内平衡，影响细胞特性和行为（图 1(C)。
【目前减轻生物打印过程中剪切力影响的方法及其局限性】
为了减轻大应力对生物打印细胞造成的影响，本研究做了一些努力。首先，从参数变量的角度出发，对喷嘴材料和喷嘴结构进行了优化。与打印喷嘴直径相比，喷头压力被认为是导致细胞存活率下降的更大因素。玻璃或陶瓷涂层喷嘴可减少喷嘴处产生的剪切应力。研究发现，在相同的打印压力下，锥形喷嘴的流量几乎是圆柱形喷嘴的 200 倍，而且锥形喷嘴比管状喷嘴更有利于保持细胞活力。研究还发现，喷嘴长度的增加、喷嘴直径的减小、打印流速的提高以及挤压式打印机打印头速度的提高都是造成细胞活力损失的潜在原因。
【体外和体内剪应力范围】
在生物打印技术中，挤压生物打印技术是组织制造过程中最方便、最商业化的技术，其次是喷墨生物打印技术，喷墨生物打印技术价格低、分辨率高，因此对细胞的应力影响是生物打印不可避免要讨论的话题。由于商业生物打印平台种类繁多，打印引起的剪切应力取决于设备和具体情况。对于典型的微挤压生物打印机（型号：EFL-509 BP6601）来说，8 毫米长的 25G 圆柱形喷嘴内径最小为 0.26 毫米，生物墨水（5 明胶甲基丙烯酰（GelMA）60）的分配压力为 15-30 千Pa。在这种情况下，喷嘴处产生的最大剪切应力约为 487.5 Pa。在常规喷墨生物打印机打印参数下，打印喷嘴处的打印诱导剪切应力约为 31.75 Pa（Inventia 生命科学公司）。然而，在一些研究中，直径为 100 微米的管状喷嘴在正常打印流速为 5.27 微升/秒的情况下，可引起高达 7002 Pa的剪切应力。
事实上，大多数体内细胞暴露于相对较低的应力水平（图 2）：淋巴细胞暴露于 0.007 至 0.008 Pa 的淋巴剪切应力；正常组织细胞暴露于间隙流，在细胞表面引起 0.01 Pa 左右的剪切应力；在血液中流动的细胞暴露于 0.05（静脉循环）至 3 Pa（动脉循环）的剪切应力。在血管内，随血液流动的细胞可在血管分叉和大血管近壁区域等关键位置瞬间受到 300 Pa 的剪切应力。从理论上讲，为细胞提供尽可能与其生理微环境相似的体外微环境有利于细胞的发育。因此，生物打印过程中的轻微应力也应考虑在内。
图2 体内生理剪切应力
【评估剪切应力对细胞影响的方法论】
许多研究的共同目标是探索细胞对剪切应力的反应。这些体外评估采用了不同的方法，有的采用悬浮细胞，有的采用粘附细胞；有的采用短时应力脉冲，有的采用长时间低应力。生物打印方案是将细胞预混合并分配成悬浮液，然后进行粘附培养。预混合和打印后培养阶段使细胞暴露在低水平应力下，而分配过程则对细胞施加瞬时高水平应力。因此，不同方法得到的细胞反应是可以参考的，所有这些应力加载条件都值得研究。在打印头喷嘴模型方面，挤压式和喷墨式生物打印系统采用了不同配置的打印喷嘴，以排出细胞播种介质或生物墨水（图 3(A)-(C)）。一些研究为了简化理论计算，将喷嘴结构分为圆柱形和圆锥形。窄管和细注射针等简单模型（图 4(D)-(F)）也可用于细胞悬浮液应力加载。在这些模型中，细胞与介质一起在圆管内流动，层流可传递给细胞的最大剪切应力可通过普瓦赛尔方程（Poiseuille's equation）计算得出。
图3 管状截面积剪应力加载方法
图4 微流体流道剪切加载装置和流变剪切加载装置
【剪切应力对细胞的影响】
到目前为止，主要有两种不同的应力传递方式。一种是在持续数小时甚至数天的较长时间内加载低水平应力，其范围在10-3 Pa 至 100 Pa 之间。另一种是在瞬时（通常为一毫秒到一秒）内加载高应力，其范围从 101 Pa 到 104 Pa。对于生物打印来说，目前对剪切应力刺激的关注主要集中在打印喷嘴上，在喷嘴上诱导的应力通常是高强度的，但却是瞬时的，以毫秒到秒为单位。然而，生物打印并不是一个独立的挤压过程。相反，它还包括打印前和打印后的程序，这些程序可对细胞产生剪切应力。例如，在制备含有细胞的生物墨水时，混合操作会给细胞带来低水平但可能持久的剪切应力。将生物墨水注入打印墨盒后，细胞需要通过管道到达打印喷嘴，这也会产生剪切应力。在打印后的细胞培养阶段，还可以通过将样品放在振动器上，使打印结构中的细胞长时间暴露在低水平的剪切应力下。细胞在不同应力模式下的应力反应不仅有助于下一代生物打印机的设计，还有助于整个生物打印过程的优化。
【剪切应力对细胞的影响——高瞬时剪应力】
高水平的瞬时剪切应力是生物打印诱导应力的典范。大多数评估生物打印相关剪切应力对细胞影响的研究都集中在这一应力水平和应力加载期上。研究人员发现哺乳动物细胞的存活能力与脉冲有关。乳腺腺癌细胞株 MDA-MB-231 和 MDA-MB-468 反复暴露于 592 Pa 的应力脉冲下，每个脉冲频率为 1.08 毫秒，两个连续脉冲之间间隔 90 秒。然而，不同的癌细胞系之间也存在差异。有研究指出，在 MCF7 和 MDA-MB-231 这两种乳腺癌细胞系中，就表型（包括基因和蛋白质表达）而言，MCF7 细胞系比 MDA-MB-231 细胞系更易受脉冲剪切应力的影响。除单细胞外，剪切应力还被证明能够刺激癌症组织球体（CTOS）的生长。用 27G（内径：220 微米）针头以 5 至 30 毫升/分钟的流速轻度分配结直肠癌细胞 C45 CTOS。然后将 CTOS 培养一周，以评估其相对生长率（图 5(A)）。可以看出，球体的生长率随传导流速的增加而增加，对照组与 20 ml min-1 组之间存在显著差异。在相应的设置下，通过一根 27G 的针，15 毫升/分钟的流速可引起 186.6 Pa左右的剪切应力，应力加载周期为毫秒级，这是循环肿瘤细胞在动脉分叉处可能经历的情况。
图5 剪切力对细胞的积极影响
【生物打印诱导剪切应力和细胞损伤的数学模型】
剪切应力是影响细胞行为的一个重要因素，为此，研究人员建立了数学模型来预测印刷引起的剪切应力和相应的细胞损伤。早期的剪切应力和细胞损伤模型主要针对血液创伤研究。1965 年，Blackshear 根据幂律模型提出了预测血液溶血的细胞损伤定律。而在本研究中，使用库埃特（Couette）剪切装置在 30 至 450 Pa 的范围内施加剪切应力，持续时间为 25 至 1250 毫秒。结果表明，当剪切应力低于 425 Pa且暴露时间少于 620 毫秒时，溶血量不会明显增加（图 6(A)）。另外，Yeleswarapu 等人在 1995 年获得的一组时变剪切力诱导溶血实验结果证明了该模型的正确性。暴露时间幂律模型的模拟结果用 BDI 表示，修改后模型的模拟结果用 BDI 表示（图 6(B)）。如图 6(B(a))所示（分别为曲线 Ψ 和曲线 ξ），对于递减和递增的时间历程，更新后的模型都能给出更好的预测结果。总之，由于细胞的脆弱性以及不同的生物打印条件和细胞类型，仍有开发更可靠数学模型的空间。这些模型不仅有助于预测细胞损伤，还有助于评估细胞的整体完整性。它将支持下一代生物喷头系统的开发，并有助于改善打印后的细胞存活情况。
图6 用于预测细胞损伤和生物打印相关参数的数学模型
2. 总结与展望
总之，哺乳动物细胞不仅对流体动力应力敏感，而且对施加应力的环境也很敏感。因此，在测试应力对细胞的影响时，必须建立标准化的实验和分析方法。开发一种能将这种影响与应力水平定量联系起来的方法，将有利于3D生物打印系统以及其他应力加载设备（包括微流控设备）的设计。当确定了不仅能保持细胞完整性，甚至还能促进特定细胞特性表达的临界应力区间后，只需调整打印参数，就能进一步优化生物打印产品的性能。
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