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骨关节炎(OA)是最常见的退行性关节疾病，以关节软骨润滑性下降为特征。如果不及时干预以恢复关节软骨的润滑，增加的摩擦力将加剧病情并最终导致残疾。因此，恢复关节软骨的润滑性能是调理骨性关节炎的关键。
为了模拟关节软骨基质的超润滑性能，已经探索了像透明质酸(HA)衍生物这样的润滑剂的使用。然而，由于HA的快速消耗，挑战依然存在。基于此，来自中国科学院的王荣和四川大学的岑啸通过甲基丙烯酸亚砜甜菜碱自由基聚合在活化的壳聚糖（CS）片段上制备了壳聚糖-嵌段聚甲基丙烯酸亚砜甜菜碱(CS-b-pSBMA)共聚物，在结构上模拟了软骨上的润滑生物分子。通过傅里叶变换红外光谱、X射线光电子能谱和1H核磁共振验证了CS-b-pSBMA共聚的成功。摩擦试验证实，CS-b-pSBMA共聚物对Ti6Al4V合金等人工关节材料的摩擦系数低至0.008，对OA模拟软骨的润滑效果优于常规润滑剂玻尿酸，并通过荧光标记实验证明了润滑剂对软骨表面的吸附作用。此外，CS-b-pSBMA润滑剂具有出色的稳定性，可以承受酶降解，甚至可以长期储存长达4周。体外研究表明，CS-b-pSBMA润滑剂具有良好的抗菌活性和生物相容性。体内实验证实CS-b-pSBMA润滑液稳定，可缓解OA小鼠软骨降解过程,这种仿生润滑剂是调理骨性关节炎和软骨修复的一种有前途的关节润滑剂。相关论文“Biomimetic zwitterionic copolymerized chitosan as an articular lubricant”于2024年1月15日发表于杂志《Carbohydrate Polymers》上。
概述图
1. 高分子合成与表征
CS-b-pSBMA共聚物的合成如图示1所示。
图示1 CS-b-pSBMA嵌段共聚物的合成及吸附在软骨表面进行润滑和OA调理示意图
CS-b-pSBMA嵌段共聚物的成功合成首先通过观察聚合物在水中的溶解度来验证(图1a)。通过FT-IR表征CS-b-pSBMA共聚物、纯CS和pSBMA的化学组成(图1b)。用XPS分析了CS-b-pSBMA共聚物的化学组成(图1c)。通过1H- NMR进一步测定了CS-b-pSBMA共聚物的化学信息(图1d)。更重要的是，CS-b-pSBMA溶液(1 mg/mL)具有显著的可注射性(图1e)，在剪切速率> 100 s-1时具有显著的流动性，粘度系数接近于零(图1f)。
图1 CS-b-pSBMA共聚物的表征
2. 润滑性能
用针板摩擦计对共聚物的润滑性能进行了评价。选择抛光的Ti6Al4V合金和PDMS半球作为衬底和摩擦头，用摩擦计以直线往复运动的形式测量COF值(图2a)。首先测量了不同浓度CS-b-pSBMA的润滑性能(图2b)。CS-b-pSBMA润滑油在浓度为1-100 mg/mL时，在长达3600 s(相当于1800次摩擦循环，总行驶距离为36 m)的摩擦测试周期内，稳定地保持了超低COF(图2c)，反映了其持久的润滑性能。此外，还测试了纯CS (1 mg/mL在1%醋酸溶液中)、均聚物pSBMA (1 mg/mL)和CS与pSBMA混合溶液(总浓度为1 mg/mL，含0.1 mg/mL CS和0.9 mg/mL pSBMA)的润滑性能。结果表明，CS溶液、pSBMA溶液和CS + pSBMA溶液的COF值分别为0.346、0.083和0.227(图2d)，而只有CS-b-pSBMA润滑剂保持了优异而稳定的润滑性能(图2e)，这表明CS、pSBMA及其混合物无法达到CS-b-pSBMA的润滑性能，CS与SBMA的共聚对改善润滑有显著作用。
图2 润滑性能
3. 润滑剂的适用性
本文研究了CS-b-pSBMA共聚物在不同加载力(1、5、10、20和50 N，分别相当于压力0.50、0.86、1.08、1.36和1.85 MPa)下的润滑性能，结果表明，在加载压力测试下，润滑油保持超低COF≤0.02(图3a-b)。此外，为了研究CS-b-pSBMA润滑剂在模拟关节腔条件下的性能，将CS-b-pSBMA共聚物溶解在不同的模拟生理介质中(即0.9% NaCl, 10 mM PBS和0.1 mg/mL BSA)。由图3c可以看出，在所有被测介质中，润滑油均表现出优异的润滑效果(COF≤0.02)，其中在NaCl溶液中润滑效果最好，COF低至0.008，表现出超润滑效果。还评估了CS-b-pSBMA润滑剂对光滑玻璃和常见植入材料(如UHMWPE)的润滑效果，以探索润滑剂在人工关节应用中的潜力(图3d)。
图3 润滑剂的适用性
4. 软骨表面的体外润滑
进一步测试了CS-b-pSBMA共聚物在消化的猪关节软骨表面的润滑性能，并将其与0.9% NaCl溶液和HA进行了比较(图4a-b)。据报道，COF与耐磨性没有直接关系，低摩擦COF并不完全代表良好的润滑剂。因此，通过扫描电镜观察摩擦前后软骨表面的磨损程度(图4c)。
图4 软骨表面的体外润滑
5. 共聚物在软骨表面的吸附作用
为了研究其润滑机理，CS-b-pSBMA共聚物被FITC标记(图5a)。将软骨样品浸入pH为6或13的FITC标记的CS-b-pSBMA润滑剂溶液中(以调节氨基的质子化)，用超纯水洗涤以去除未键合的共聚物，然后立即记录荧光润滑剂在软骨表面的分布情况(图5b)。结果表明，当FITC标记的 CS-b-pSBMA溶液的pH为6时，标记后的软骨表面呈现明显的荧光分布(图5c)，表明FITC标记的CS-b-pSBMA共聚物可以有效地吸附到软骨表面。然而，当溶液pH增加到13时，软骨表面的荧光强度下降，这很可能是因为碱性条件抑制了CS段上氨基的质子化过程，减少了共聚物对关节软骨的静电吸附。定量结果也证实了pH值为6时软骨表面荧光强度高于pH值为13时(图5d)。
图5 共聚物在软骨表面的吸附作用
6. 体外抗菌性能及生物相容性
研究了CS-b-pSBMA润滑剂对常见病原菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性。为了模拟滑膜液(含蛋白质、多糖等)对细菌的有利环境，在PBS缓冲液中加入浓度为1 vol%的培养基，创造有利于细菌生长的环境。结果表明，CS-b-pSBMA润滑剂具有一定的抗菌性能(图6a-c)。更重要的是，作为一种可注射润滑剂，生物相容性是其应用的首要前提。从SD大鼠膝关节软骨中分离软骨细胞用于CS-bpSBMA润滑剂的细胞毒性评估，并通过CCK-8检测和Live/Dead染色评估细胞活力(图6d-e)。
图6 体外抗菌性能及生物相容性
7. 润滑剂的生物降解性
本研究考察了CS-b-pSBMA共聚物与LZ和HAase孵育后的润滑性能。以HAase处理的HA溶液(10 mg/mL)为对照。可以看出，CS-b-pSBMA润滑油经过LZ和HAase处理后仍保持了优异的润滑效果(图7a)，稳定性可靠。CS-b-pSBMA润滑剂的稳定性通过在37℃的摇浴中孵育长达28天来进一步评估。观察到CS-b-pSBMA润滑剂的COF值随着孵育时间的增加逐渐增加，从第1天的0.013增加到第7天的0.018(图7b)，说明共聚物的结构在孵育时间延长的过程中可能发生分解。此外，将荧光标记的润滑剂(FITC-CS-b-pSBMA)皮下注射到小鼠体内，用IVIS记录小鼠皮肤下的荧光信号，观察润滑剂在体内的滞留时间。观察到，荧光信号在小鼠皮下可保留长达28天(图7c)，这表明CS-b-pSBMA润滑剂在体内长期抵抗生物降解，从而减少了OA调理中润滑剂注射的频率。
图7 润滑剂的生物降解性
8. 体内性能
最后，通过MIA诱导的OA小鼠，研究CS-b-pSBMA润滑剂在体内的调理作用。动物实验时间及处理流程如图8a所示。三维重建后的显微CT图像显示，除假手术组外，其余各组均有MIA损伤软骨下骨，而NaCl组损伤较HA组和CS-b-pSBMA润滑剂组更为严重(图8b)，术后软骨下骨损伤更小，完整性更好。采用H&E、甲苯胺蓝、红素O -耐晒绿染色对关节软骨进行组织学分析。如图8c所示，假手术组软骨表面光滑连续，结构清晰，细胞结构正常。免疫组化分析软骨组织中SOX9和MMP13蛋白的表达。与NaCl组相比，假手术组和CS-b-pSBMA组SOX9表达蛋白水平显著升高，MMP13表达蛋白水平显著降低(图9)。
图8 体内润滑性能
图9 免疫组织化学染色
总之，本研究通过廉价易得的CS和SBMA的嵌段共聚反应，在不使用有毒有机溶剂的情况下，研制了一种仿生CS-b-PSBMA润滑剂。证明了该润滑剂的吸附机理有利于共聚物的稳定润滑。值得注意的是，CS-b-PSBMA共聚物在Ti6Al4V合金、玻璃和UHMWPE等人工关节材料上，甚至在消化的猪关节软骨上，表现出比常用的HA溶液更优异的润滑效果。
此外，CS-b-PSBMA润滑剂耐酶处理，体内外稳定性好，最长可达4周。体外实验表明，该共聚物具有明显的抗菌性能和良好的生物相容性。初步动物研究表明，CS-b-PSBMA润滑剂能够减缓骨性关节炎软骨破坏的进展。可以预期，使用CS-b-PSBMA作为注射润滑剂，与传统的HA注射相比，OA的调理间隔可以延长。综上，这种CS-b-PSBMA润滑剂达到了CS和PSBMA的协同作用，是一种很有前途的调理骨性关节炎的仿生润滑剂。
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