引言

Hayflick和Moorhead首次发表的细胞衰老研究将其定义为人成纤维细胞的极限增殖能力【1】。自此之后，研究人员通过细胞培养系统在衰老诱导剂和细胞衰老基本机制方面取得了巨大的进步。动物模型和人体样本中的研究发现了细胞衰老对生理和病理机制的影响。然而，当前研究人员在体内鉴定衰老细胞的过程中，面临着一些概念、方法和操作上的挑战。比如，一个重要的限制是，之前发现的一些经典的细胞衰老marker基因都是在细胞培养模型中发现的，但在天然组织微环境中，这些marker基因的表达并不一致。为此，建立切实可行的衰老研究方法、策略等成为当前衰老研究的共识。

2024年8月8日，来自荷兰格罗宁根大学的Marco Demaria以及奥地利维也纳农业大学的Johannes Grillari带领团队在Cell发表了文章Guidelines for minimal information on cellular senescence experimentation in vivo，他们分别从功能影响、组织差异、动物模型、人体样本等方面总结了细胞衰老研究的最新进展，总结了细胞衰老研究的最少信息：“minimum information for cellular senescence experimentation in vivo”（MICSE），为细胞衰老研究指明了方向【2,3】。

1. 原位细胞衰老标志物的功能、可靠性在体内检测细胞衰老不能依赖单独的marker，必须要综合多个指标对细胞衰老进行鉴定。然而，现在的问题是，并不能确定哪一个指标和衰老最相关，以及多少指标能够保证衰老的成功鉴定。为此研究人员总结了与衰老密切相关的一些特征，描述了其对衰老功能的影响及在衰老研究中的应用：诱导细胞周期抑制因子表达。细胞周期停滞是细胞衰老的核心表型之一，抑制细胞增殖相关基因的表达可作为原位检测细胞衰老的主要指标，比如CDK抑制因子p21和p16是衰老细胞中主要表达的增殖抑制因子。另外，p15、p19和p27也和衰老相关，不过这些因子的作用还需要更深入的研究。对于上述CDK抑制因子的检测，可通过mRNA以及抗体进行检测，另外，这些因子相关的一些转基因报告小鼠模型以及敲除鼠模型已经用于在体检测其对衰老的作用。P21和p16推荐作为衰老检测的第一指标。细胞增殖下降。细胞周期停滞是细胞衰老的一大特征，通过检测细胞周期进展相关基因可评估细胞的原位增殖情况，比如PCNA和Ki67等。这两个基因还能评估细胞处于哪个分裂期，因为PCNA在S期表达水平最高，而Ki67则在M期表达水平最高。另外，胸苷类似物如BrdU和EdU等物质能够标记正在复制的DNA，也被用于评估细胞增殖。不过，体外培养细胞与体内细胞的增殖效率存在很大差异，体外培养细胞增殖效率很高，但体内某些细胞可能几周或者几个月才分裂一次，通过PCNA和Ki67评估细胞仅能用于体外实验，体内实验中，这种方法仅可作为备用指标。核被膜受到侵蚀。核被膜保证了染色质的结构完整和稳定，在细胞衰老的过程中，核被膜的一些主要成分表达下调，比如LMNB1，这个可以作为原位检测细胞衰老的指标之一。对于LMNB1的检测，可通过特异性抗体检测其定位和表达。不过，LMNB1在不同的细胞中的基础表达水平并不一致，这会对检测和分析细胞衰老程度有影响。警报素的激活。当组织受到应激或者损伤时会快速分泌警报素（alarmins），比如HMGB1（high-mobility group box 1）蛋白，它是染色质结合蛋白，能够与组蛋白和转录因子结合。在应激条件下，HMGB1会从细胞核转位到细胞质，并分泌到胞外空间，并对周围的细胞发挥旁分泌作用。细胞衰老的早期阶段会分泌HMGB1，不过HMGB1的分泌也受到其他组织损伤的诱导，因此HMGB1的分泌无法独立作为细胞衰老的标志，需要与其他指标联合进行分析。DNA损伤。DNA损伤，尤其是双链断裂（double-strand breaks, DSBs）是细胞衰老的一个明显标志，这会导致DNA损伤反应（DNA damage response, DDR），并引起细胞周期停滞和衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）因子的表达。细胞衰老诱导的DSB常发生在端粒处，不过DSB的发生也不仅是由细胞衰老引起，其他组织损伤也会诱发DSB的发生，因此DSB的检测也仅可作为辅助指标分析细胞衰老。除了上述特征之外，细胞衰老过程中还有其他许多特征，比如着丝粒卫星的去凝集、细胞分泌表型的改变、细胞代谢重编程、氧化应激损伤加重、溶酶体功能失调等，这些特征大多无法单独作为细胞衰老的检测指标，但可作为分析细胞衰老发生的辅助证据，可根据实验进行选择。2. 不同组织中细胞衰老的异质性原位或者在体检测细胞衰老复杂的地方在于不同器官和细胞类型中衰老表型的异质性。在体检测细胞衰老需要考虑到几个难题，一是没有一个单独的指标能够评估衰老的状态，二是不同的细胞类型可能对衰老具有抗性，三是不同的细胞类型可能具有不同的衰老表型。不同的器官或者组织，其细胞衰老具有其独特的表型。例如，在大脑中具有增殖能力的神经胶质细胞以及有丝分裂后的神经元在衰老、肥胖、神经退行性病变的过程中表达衰老相关的marker。分析大脑中的衰老现象还需要考虑不同的脑区以及不同的细胞类型，这些差异会造成衰老marker的差异。其他组织如皮肤、肺、骨骼、肝脏、脂肪组织、骨骼肌以及免疫系统中都会发生细胞衰老，但一个共性的问题是，不同的细胞类型中衰老的程度和表型存在巨大差异，p21/p16、SASP因子、DNA损伤等是主要的检测指标。依据实验要求的不同进行差异化分析是检测衰老需要考虑的问题。3. 转基因小鼠模型目前，一些衰老标志基因敲除或者过表达转基因小鼠已经在众多研究中得到使用，比如p16-KO和p21-KO小鼠。这些小鼠模型在衰老研究中得到广泛应用，但需要注意的是，p21、p16以及TP53等基因的敲除不仅影响细胞衰老，还影响小鼠其它生理过程，因此这些小鼠的一些表型可能和衰老无关。另外，一些组成性敲除或者过表达基因小鼠，从小鼠胚胎发育开始便已经出现了相应表型，这与衰老发生在老龄阶段是不一样的，这会影响小鼠的表型。因此，推荐采用条件敲除或者诱导敲除策略，这样会避免一些早期干扰。除了上述模型之外，一些其它能够诱导衰老的策略也被用于表型研究，比如能够快速缩短端粒、诱发有丝分裂损伤以及DNA修复缺陷等方法也会在小鼠中诱发细胞衰老。另外，一些衰老特征基因的表达可以在小鼠中标记衰老的细胞，比如p21和p16，通过构建荧光或者其他标签蛋白knock-in小鼠可以用于衰老细胞的定位及检测，不过需要注意的是，这些标志基因的表达水平以及信号检测的背景噪音会影响结果，需要联合其它检测指标共同进行分析。同样，这些标志基因也可联合凋亡信号启动衰老细胞的自我清除机制，这也是当前研究的热门应用。本文作者还总结了非哺乳动物衰老模型，多组学技术在动物衰老样本研究中的应用，以及癌症和人体样本中衰老的研究现状，并根据这些内容总结了衰老研究的路线指南：即首先检测细胞周期停滞蛋白p21和p16，第二步是通过其他表型确认衰老是否确实发生，第三步是通过转基因敲除或者其他方法消除衰老细胞，第四步是确定消除衰老细胞后对衰老表型的影响。模式图（Credit: Cell）本文不仅总结了当前衰老研究的详细进展，还为未来衰老的研究提出了切实可行的技术路线，为靶向衰老解决一系列疾病提供了坚实的方法和范式。

参考文献

1. Hayflick, L., and Moorhead, P.S. (1961). The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp. Cell Res. 25, 585–621.2. The´ ry, C., Witwer, K.W., Aikawa, E., Alcaraz, M.J., Anderson, J.D., Andriantsitohaina, R., Antoniou, A., Arab, T., Archer, F., Atkin-Smith, G.K., et al. (2018). Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society forExtracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J. Extracell. Vesicles 7, 1535750.3. Brazma, A., Hingamp, P., Quackenbush, J., Sherlock, G., Spellman, P., Stoeckert, C., Aach, J., Ansorge, W., Ball, C.A., Causton, H.C., et al. (2001). Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data. Nat. Genet. 29, 365–371.https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.05.059

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文章来源|“BioArt”

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