前言

细胞培养是指将细胞从动物或植物体内取出，然后在适宜的人工环境中生长的过程。细胞可以在培养前直接从组织中取出并通过酶或机械方法进行解离，也可以来源于已建立的细胞系或细胞株。

细胞培养又具体分为细胞传代、换液、冻存、复苏等一系列过程，每个步骤都对应着不同的操作技术要点，想要养好细胞，每一步都必须掌握。

细胞复苏

细胞复苏是指将休眠的细胞重新活化，使之重新生长，分裂产生子细胞的过程。复苏后的细胞可重新进入细胞周期，获得细胞类型特异的生物学功能。复苏细胞一般采用快速融化法，以保证细胞外结晶快速融化，避免慢速融化产生的水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。

操作步骤：

1. 从液氮中取出冻存的细胞，迅速将冻存管放入37℃水浴快速融解。

2. 在生物安全柜或超净台中，将解冻后的细胞悬液缓慢加入5mL预温的细胞培养基。

3. 1200rpm 离心3min，吸掉上清，加入10mL培养基重悬细胞。

4. 将细胞均匀铺到培养皿中，水平十字振动培养皿使细胞均匀分布，5% CO2的 37℃恒温细胞培养箱中培养24小时后观察细胞状态。

5. 24h后更换新鲜细胞培养基继续培养，每2-3天更换培养液。

注意细节：

从液氮罐中拿出冻存管时要做好防护工作，需配备防冻手套和护目镜；

水浴锅温度：严格控制在37℃，且解冻时冻存管管口切勿浸没到水中；

复苏接种密度：一管细胞（1×10^6个）接种到1个T25（底面积25cm2）中，摇匀后置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

细胞传代培养

传代培养中的细胞传代培养,当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿(瓶)内，再进行培养。这个过程就称为传代或者再培养。对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。

操作步骤：

1. 在显微镜下观察细胞，当细胞融合度达到 90%，即可传代。

2. 在超净台/安全柜中，吸掉原有培养基，加入PBS 溶液清洗一次，加入细胞消化液使之完全覆盖皿/瓶底。

3. 室温孵育4-5分钟或37℃孵育 2-4 分钟，显微镜下观察大部分细胞脱离皿底即停止消化。

4. 加入消化液2倍体积的人间充质干细胞培养基，用移液器轻轻吹打瓶壁上未完全脱离的细胞，并轻轻吹打混匀，使细胞完全分散。

5. 将细胞悬液转移到15mL离心管中，1200rpm离心3min。

6. 弃上清，加入人间充质干细胞培养基，重悬细胞，计数。1:3-1:4比例传代，或按 1-2x10^4cells/cm2传代，均匀铺在培养皿/瓶中，置于37℃,5%CO2培养箱中培养。

注意细节：

细胞传代所需的时间:2-4天。5代及之前的细胞，生长速度较快。5 代以后的细胞，生长速度稍缓；

消化时间需要同时考虑到细胞本身特性，细胞密度，胰酶浓度等多方面因素，灵活调整，切忌生搬硬套；

传代过程中加入任何试剂都应该轻柔缓慢的加到皿壁，切忌直接加到细胞面上，如果细胞本身贴壁能力较差，可能导致细胞凋亡。

细胞冻存

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。

操作步骤：

1. 细胞达到90%汇合度，吸掉原有培养基，PBS清洗一次。

2. 加入细胞消化液使之完全覆盖皿/瓶底，室温孵育4-5min或37℃孵育2-4min

分钟，显微镜下观察大部分细胞脱离皿底即停止消化。

3. 加入消化液2倍体积的人间充质干细胞培养基，用移液枪轻轻吹打瓶壁上未完全脱离的细胞，并轻轻吹打混匀，使细胞完全分散。

4. 将细胞悬液转移到15mL离心管中，1200rpm离心3min，吸掉上清。

5. 加入适量无血清细胞冻存液，调整细胞冻存密度在1×10^6cells/mL左右，每支冻存管分装1.5-2ml。

6. 直接放入-80℃，24h后转入液氮中长期保存。

注意细节：

细胞如果是第一次养，建议至少冻存两个批次以上，以尽量避免因为冻存问题导致细胞绝种；

如果没有程序降温盒，可以将冻存细胞依次放于4℃1h，-20℃2h，-80℃过夜，大部分细胞也可以适应，但原代细胞不建议这么处理。

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