细胞宝宝很娇弱，所以需要呵护照料。细胞培养需要无菌的环境，以保证无微生物污染。

1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以酒精擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以酒精擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。

2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。

3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台。

5. 定期检测下列项目：

1）CO2 钢瓶之CO2 压力

2）CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。

3）无菌操作台内之空气流动压力，定期更换紫外线灯管及空气过滤器过滤膜。

6. 水槽可添加消毒剂，定期更换水槽的水。

细胞培养需要控制细胞所处的温度、pH、渗透压、O2和CO2。

pH：大部分细胞在pH 7.4左右生长良好。

CO2：一般需要在专用的二氧化碳培养箱中培养，设置为5% CO2。

温度：大部分哺乳动物细胞培养温度为37°C。禽类细胞在38.5°C生长最佳。昆虫细胞最佳生长温度是27°C。冷血动物细胞系可在15-26°C范围内培养。

细胞培养容器：大多数细胞系在专用的细胞培养瓶上生长，不需要特殊的基质等。但一些细胞，特别是原代细胞，需要在特殊的基质（如胶原蛋白）上生长，以促进细胞贴壁、分化或生长。

细胞培养又具体分为细胞传代、换液、冻存、复苏等一系列过程，每个步骤都对应着不同的操作技术要点，想要养好细胞，每一步都必须掌握。

细胞传代

一般细胞融合度达到约80%（即80%的培养瓶表面被单层细胞覆盖）时，即需要进行传代培养。不建议细胞过度融合（达到100%）时传代，因为这可能会影响细胞活性。

细胞传代需要注意分板比/接种密度。不同的细胞系通常需要满足特定的分板比/接种密度，务必查看所用细胞系的培养指南。生长较快的细胞可能需要高分板比（低接种密度），而生长缓慢的细胞可能需要低分板比（较高接种密度）。

如果细胞长时间无人看管（例如公共假日或周末），建议使用低于正常水平的分板比/接种密度。但是一些细胞，特别是原代细胞生长具有密度依赖性，过低的接种密度可能导致无法生长。

细胞分板比/接种密度需要通过对样品中的细胞计数确定。细胞计数一般可使用血细胞计数板。

01. 贴壁细胞系>>

贴壁细胞一般需要使用胰蛋白酶等消化液，但其可能会损伤细胞，还可能会诱使某些膜蛋白暂时内化。这时，可使用其他温和消化试剂替代（推荐产品：埃泽思PSC温和消化酶AC-1001004）。操作步骤：

注意点：

PBS洗涤（推荐产品：埃泽思PBS/磷酸盐缓冲液(不含钙.镁)AC-1001037）是为完全除去残留的胎牛血清（FBS）、钙和镁等。必要时可多次洗涤（某些细胞系贴壁牢固，需多次冲洗才能彻底去除残留 FBS），促进胰蛋白酶消化。

胰蛋白酶用量以覆盖培养瓶底部为宜，轻轻转动培养瓶，确保消化液与所有细胞接触。

将培养瓶放入37℃ 培养箱中，更适合消化酶的消化。不同细胞消化时间不同，为避免因过度消化而严重破坏细胞，必须每隔几分钟进行一次检查。

02. 半贴壁细胞系>>

一些细胞系介于悬浮和贴壁细胞之间，针对松散贴壁细胞，可不使用消化液，而使用移液管温柔吹打，使细胞分散。操作步骤：

03. 悬浮细胞系>>

悬浮细胞传代难度略低于贴壁细胞，无需经消化处理。操作步骤：

注意点：

一些悬浮细胞生长过程中可能结团，可添加解离试剂使团块分散。

悬浮细胞多次传代后，细胞碎片和代谢废物会不断积累，可将细胞悬液以 100Xg离心5-10分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬在新鲜培养基中。

细胞冻存

利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。

操作步骤：

1. 细胞达到90%汇合度，吸掉原有培养基，PBS清洗一次。

2. 加入细胞消化液使之完全覆盖皿/瓶底，室温孵育4-5min或37℃孵育2-4min分钟，显微镜下观察大部分细胞脱离皿底即停止消化。

3. 加入消化液2倍体积的人间充质干细胞培养基，用移液枪轻轻吹打瓶壁上未完全脱离的细胞，并轻轻吹打混匀，使细胞完全分散。

4. 将细胞悬液转移到15mL离心管中，1200rpm离心3min，吸掉上清。

5. 加入适量无血清细胞冻存液（推荐产品：埃泽思无血清细胞冻存液（治疗级） AC-1001006），调整细胞冻存密度在1×106cells/mL左右，每支冻存管分装1.5-2ml。

6. 直接放入-80℃，24h后转入液氮中长期保存。

注意点：

1. 细胞如果是第一次养，建议至少冻存两个批次以上，以尽量避免因为冻存问题导致细胞绝种；

2. 如果没有程序降温盒，可以将冻存细胞依次放于4℃1h，-20℃2h，-80℃过夜，大部分细胞也可以适应，但原代细胞不建议这么处理。

细胞复苏

细胞复苏是指将休眠的细胞重新活化，使之重新生长，分裂产生子细胞的过程。复苏后的细胞可重新进入细胞周期，获得细胞类型特异的生物学功能。复苏细胞一般采用快速融化法，以保证细胞外结晶快速融化，避免慢速融化产生的水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。

1. 从液氮中取出冻存的细胞，迅速将冻存管放入37℃水浴快速融解。

2. 在生物安全柜或超净台中，将解冻后的细胞悬液缓慢加入5mL预温的细胞培养基（推荐产品：埃泽思人脐带间充质干细胞无血清培养基AC-1001043）。

3. 1200rpm 离心3min，吸掉上清，加入10mL培养基重悬细胞。

4. 将细胞均匀铺到培养皿中，水平十字振动培养皿使细胞均匀分布，5% CO2的 37℃恒温细胞培养箱中培养24小时后观察细胞状态。

5. 24h后更换新鲜细胞培养基继续培养，每2-3天更换培养液。

注意点：

1. 从液氮罐中拿出冻存管时要做好防护工作，需配备防冻手套和护目镜；

2. 水浴锅温度：严格控制在37℃，且解冻时冻存管管口切勿浸没到水中；

3. 复苏接种密度：一管细胞（1×106个）接种到1个T25（底面积25cm2）中，摇匀后置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

AC-1001004 PSC温和消化酶 100mL

* 对细胞消化温和，减少对PSC细胞膜结构破坏；

* 消化后细胞可直接贴壁，简化传代流程:

* 无动物源，质量稳定，无批间差异;

* 低热源，内毒素水平<0.12EU/mL，适用于细胞治疗应用。

AC-1001006 无血清细胞冻存液（治疗级）100mL

* 所有成分均为原料药级别，合规性高，符合药品申报要求；

* 无动物源成分，无各类病毒、细菌，霉菌和支原体等污染；

* 即用型产品，无需程序降温，冻存于-80℃冰箱或液氨中长期保存；

* 低热源，减少外源内毒素干扰，适用于细胞治疗应用；

* 冻存细胞复苏率高，常见细胞复苏率普遍高于95%。

AC-1001043/(PRF) 人脐带间充质干细胞无血清培养基/(PRF) 基础培养基450mL，添加剂50mL

* 专为脐带间充质干细胞分离与扩增优化，传代稳定性高，最高可达20代

* 全程无血清生产，极大降低批次间差异

* 可用于原代分离，且培养过程无需包被培养板;

* 无外源动物成分，大大降低各类病毒，霉菌和支原体等的污染风险

* 低热源，内毒素水平<0.12EU/mL，适用于细胞治疗应用。

AC-1001037 磷酸盐缓冲液(不含钙.镁) 500mL

* 使用细物培养级水配制，无重全属离子以及其他杂质

* 0.1um 过滤，无细菌，无真菌，无支原体

* 内毒素<0.06EU/ml，远低于中国药典水平