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神经类器官可用于理解神经元连接并探索神经系统疾病。这些三维（3D）组织的一个显著特征是它们的自发神经活动，脑类器官的电生理成熟与它们的形态和细胞发育相关联。记录这种电生理活动在多个领域都有很大的作用。前脑类器官中的网络级事件反映了人类新生儿脑电图的特征，提供了一个早期大脑网络发育的潜在模型。此外，评估神经类器官在机械创伤后的电生理失调成为疾病建模的方法为创伤性脑损伤提供了经验。然而，传统的微电极阵列（MEAs）仅限于在二维平面上测量电生理活动，无法捕捉到三维（3D）组织如神经类器官和球状体的复杂性。
来自瑞士洛桑联邦理工学院的Stéphanie P. Lacour团队介绍了一种花形的MEA（e-Flower），它能够通过仅添加细胞培养基来包裹亚毫米级的脑细胞球。受软夹钳启发，其驱动机制利用了接枝在聚酰亚胺基底上的聚丙烯酸水凝胶的膨胀特性，该基底承载着电气互连。e-Flower兼容标准电生理记录系统，不需要额外的设备或溶剂，并且可以与预成型的3D组织一起使用。本文设计了一种e-Flower，能在几分钟内实现低至300微米的曲率，这一值可以通过选择再膨胀介质和水凝胶交联剂浓度来调节。此外，本文还展示了e-Flower检测球状体表面自发神经元活动的能力，展示了其在全面神经信号记录方面的潜力。相关工作以题为“The e-Flower: A hydrogel-actuated 3D MEA for brain spheroid electrophysiology”的文章发表在2024年10月16日的期刊《Science Advances》。
1.创新型研究内容
本文开发了一种e-Flower，其是一个直观的3D MEA平台，它包裹脑细胞球并使其整个表面都能进行记录。受软夹钳和混合水凝胶-聚合物双层结构启发，e-Flower的独特之处在于其对细胞友好的机械驱动，这是由柔软的水凝胶膨胀特性所驱动，并通过添加细胞培养基来触发。e-Flower由一片花形聚酰亚胺（PI）薄膜组成，分为四个初始平坦的花瓣，每个花瓣上都有八个铂（Pt）微电极，并在其背面涂有一层接枝在上的聚丙烯酸（PAA）水凝胶。通过精确调整水凝胶配方、双层厚度和MEA几何形状，本文成功地设计了一个半径为300微米的3D MEA平台，因此与本文的目标脑细胞球兼容。此外，e-Flower与市售的电生理记录系统无缝对接为神经生理学研究提供了一个用户友好的即插即用解决方案。为了加快和指导设计和微加工过程，本文对设备的每个组件进行了全面的机械和电气表征，并开发了预测性的计算机有限元模型。最终，本文开发了一个概念验证，展示了e-Flower的潜力，成功记录了脑细胞球的3D电生理活动。这项技术为球状体和类器官的3D电生理学打开了以前无法识别的可行途径。
图1 e-Flower：一种具有细胞友好型机械致动和多功能即插即用功能的3D MEA
【聚丙烯酸水凝胶的表征】
再膨胀介质对PAA水凝胶中观察到的溶胀行为有显著影响。总体而言，与去离子水（DI）相比，在细胞培养基（CCM）中再膨胀的水凝胶在质量、面积和厚度变化方面表现出较低的溶胀水平。在CCM中再膨胀的水凝胶在质量上比在DI中再膨胀的水凝胶少膨胀近50%，而磷酸盐缓冲液（PBS）条件下的值介于这两者之间（图2A）。初始溶胀阶段的斜率也表明溶胀速率取决于介质，其中PBS最慢。此外，在CCM中膨胀的PAA凝胶在约60分钟后显示出过冲响应（25℃时66倍，37℃时60倍），这种行为在之前的文献中有被报道。这种行为可能与聚合物网络中的氢键形成或溶剂-聚合物相互作用的变化有关。尽管观察到这种过冲现象，但与平衡溶胀值相比意义不大。因此，预计当e-Flower浸入CCM中时，不会对其功能产生不利影响。测量完全膨胀样品的相对面积变化（数量级，1平方厘米）（图2B），在温暖的CCM中再膨胀导致面积增加约比DI低七倍（分别为温暖CCM 0.27，室温CCM 0.4，PBS 1.00，DI 1.90）。同样，考虑到厚度溶胀比，温暖的CCM中再膨胀的样品比DI等效物薄33%，如图2C所示。这种溶胀行为的差异可能是由于再膨胀介质与水凝胶的聚合物基质之间的静电相互作用，并进一步受到CCM中存在的复杂分子（如氨基酸）的影响。为可视化水凝胶在不同再膨胀介质下的可能形态差异，本文获得了之前浸泡在DI（图2J）或CCM（图2K）中的冷冻干燥样品的扫描电子显微镜（SEM）图像。在DI中再膨胀的水凝胶显示出开放孔洞泡沫形态，具有大直径（约50微米）的孔和薄的细胞壁。相反，在CCM中再膨胀的水凝胶显示出更密的凝胶细胞壁，这可能是由于CCM中的营养物质和其他活性成分与水凝胶网络相互作用所致。
图2 PAA水凝胶再膨胀
【混合聚酰胺/聚酰亚胺双层】
为了表征构成e-Flower每个花瓣的PAA/PI双层的弯曲特性，本文重点关注最简单的双层形状，即矩形条。本文的目标是获得一个适用于3D包裹在神经球体上的定制曲率半径。已知双层的曲率受到水凝胶/聚合物厚度比的影响。为保证一致性，将PI的厚度固定在6微米，而PAA的厚度则保持在150微米。随后，将研究重点放在重胀介质和交联剂浓度对双层曲率的影响上。这一过程包括通过旋涂制备PI层，然后固化PI并嫁接水凝胶。为了使PAA与PI共价嫁接，在PI基材上溅射了一层15纳米厚的SiOX薄层，接着使用3-(三甲氧基硅烷)丙烯酸甲酯（TMSPMA）进行硅烷化处理。然后在TMSPMA功能化的PI表面上直接分配并固化PAA预凝胶溶液，同时使用定制模具控制其厚度。图3A展示了一条在CCM中达到平衡肿胀状态的代表性双层条的光学显微镜照片，图中虚线圆圈用于手动评估双层的曲率半径。结果表明：双层的曲率取决于重胀介质，如图3B所示。在DI中，双层条的曲率半径减小到99微米，而在PBS中增加到208微米，在CCM中几乎增加了两倍（分别为285和295微米，温度分别为室温和37℃）。同样，图3C报告了交联剂浓度对在温暖CCM中肿胀的同一条带曲率半径的影响。在这种情况下，增加交联剂浓度导致弯曲程度较小，4X（257微米）和16X样本（221微米）的曲率半径分别比基础样本1X（295微米）小13%和33%。这种行为是由于面积相对膨胀比和硬度的变化导致的，这两者之前已在整体水凝胶内进行了评估。值得注意的是，当在37℃的CCM中肿胀时，含有1X交联剂浓度的双层达到了300微米的曲率半径，符合我们期望的大小范围。因此，在所有后续实验中我们都保持了这一配方。图3D显示了一条在DI中肿胀的冻干双层条的SEM显微图，展示了共价嫁接在PI层（黄色）表面的水凝胶（蓝色）的形态。冻干样品进一步验证了水凝胶与PI层之间的牢固分子级附着，因为它们经受住了包括反复干燥-膨胀循环、快速冷冻和冻干在内的严格处理。值得一提的是，冻干过程改变了双层的曲率半径。
图3 PAA/PI混合双层
【e-Flower的设计与表征】
在确认花形双层结构有效闭合后，本文继续在其PI花瓣内集成Pt电极。本文设计了一种e-Flower几何形状，包括分布在四个PI花瓣上的32个直径为30微米的Pt电极，如图4A所示。此外，在MEA的非驱动部分放置了一个宽度为800微米的方形参考电极，该电极将用于电生理记录中的参考。与没有金属化的花形双层结构一样，本文将e-Flower的花瓣通过四条臂（或桥）连接到阵列主体上。这些臂有两个作用：它们将e-Flower固定在位，便于操作，并且它们承载着连接活动电极到接触垫的电气轨道。最后，我们将e-Flower的垫片排列成矩形阵列，以便与市售的MEA-2100记录平台的pogo针接口连接。
为了在MEA的背面嫁接水凝胶，本文开发了一种微制造工艺流程，其中电极是倒置制造的，并且水凝胶致动层仅限于花形区域。本文使用标准薄膜技术和光刻图案化来制造金属轨道。为确保倒置处理中金属层的连续性，本文进行了热回流处理（150℃，30秒），以使光刻胶侧壁平滑并定义电极和垫片开口（步骤3）。图4A（插图）中的SEM图像展示了一个代表性的Pt电极。然后本文按照前面段落所述的方法将PAA水凝胶嫁接在PI上。最终的e-Flower截面包括：（i）3微米的顶部PI封装层；（ii）形成电极和互连的150纳米Pt层；（iii）3微米的底部PI封装层；（iv）用于水凝胶嫁接的15纳米SiOX层；（v）150微米厚的PAA层（按制备状态）。为了便于CCM更换，我们将e-Flower集成在一个聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）流动通道内，如图4（A和B）所示。流动通道包括必要的组件，如入口、出口、培养室和一个可拆卸的盖子，用于保护培养的组织。e-Flower被放置在培养室的中心，确保其完全或部分浸没在CCM中。图4C显示了e-Flower在达到闭合构型时安装在流动通道中的状态，当其浸没在溶液中时。
图4 e-Flower的设计与电化学表征
【e-Flower中神经球体的整合】
在成功制造和电化学表征e-Flower之后，本文的重点转向了实现设备功能的概念验证。主要是进行电生理记录，以展示e-Flower捕获脑细胞球神经活动的能力。为此，本文选取了一个1岁的脑细胞球，并将其连同少量CCM（<200 μl）一起小心地转移到开放的e-Flower上（图5A）。随着水凝胶开始膨胀，它触发了e-Flower从二维到三维的重新配置，在几分钟内包裹住球体并使电极靠近其表面。作为最后一步，本文引入额外的CCM填充流体通道，并将e-Flower转移到培养箱中。经过8小时的稳定期后，从培养箱中取出e-Flower，并将其转移到电生理装置上。能够获得球体表面自发场电位的三维记录，如图5B所示。叠加的场电位波形显示出独特的模式，每个模式的平均持续时间约为2毫秒。记录的活动与先前研究中收集到的活动相当。为了确定所记录信号的神经起源，本文通过提高细胞外K+浓度进行了神经活动的化学操作，这是一种已知的抑制峰电活动的方法。具体来说，将细胞外KCl浓度提高到100 mM，这是标准CCM配方中K+浓度（5 mM）的20倍。图5C中的栅格图显示了在高KCl浓度孵育期间自发神经活动的显著减少，随后恢复。这一观察结果强调了所记录信号的神经特性。此外，电极的噪声水平在整个实验过程中保持稳定，突出了电极在多次介质更换和洗涤步骤中的稳定性。最后，为确保增加的K+浓度不会改变设备的曲率半径，我们验证了类似再膨胀条件下花形PAA/PI双层的直径没有发生重大变化。
图5 脑细胞球自发神经活动的三维时空记录
2.总结与展望
本文开发了一种e-Flower，是一种由细胞培养基（CCM）驱动的自折叠微电极阵列（MEA），旨在监测脑细胞球的三维功能性电活动，其三维驱动是由聚丙烯酸（PAA）的水凝胶膨胀特性所驱动的。在当前配置下，e-Flower的花瓣可以达到至少300微米的曲率半径，这取决于所使用的再膨胀介质和合成聚丙烯酸水凝胶时采用的交联剂浓度。e-Flower在其聚酰亚胺（PI）结构内嵌入了32个薄膜电极，本文展示了至少三次可逆地打开和关闭的能力。最后，本文展示了一个概念验证，证明了e-Flower能够检测到整个球体表面的自发神经模式。
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