文：回溯档案

编辑：回溯档案

新鲜的水果和蔬菜是卵囊传播的一个可能来源，因为这种寄生虫可以在土壤和水中长期存在并具有传染性。

以此，我们进行探索研究新鲜的蔬菜和水果是怎样受到污染的，以及如何有效清理绿色植物中的卵囊。

是如何被是如何被污染的，食物样本

在2018年7月n至2019年7月n期间，葡萄牙和西班牙的几个地方共从当地生产者那里收集了35种散装、包装和即食蔬菜和浆果水果，这些蔬菜和浆果由零售商提供，或在大型小型超级市场购买。

弓形虫卵囊回收

浓度和回收T. gondii卵囊，还有隐孢子虫特别方案，用过滤/免疫磁分离/荧光法对水果和蔬菜样品中的囊肿进行检测，简单地说水果和蔬菜都是用手动旋涡在20、50或100升的水箱中，用大量的蒸馏水，按每一个样品的大小，至少冲洗10分钟。

用了十升蒸馏水清洗平均440克样品，用于洗水过滤一个，1元的最大滤网使用过滤器在三杆上应用于蠕动泵，洗脱是在一个最大的电影里进行的手动清洗站，浓缩为3毫升磷酸缓冲溶液，20-20，离心1000×后g在室温下呆10分钟。

将与特定抗体结合的磁珠加入精矿中，并将其磁化，隐孢子虫卵囊和贾迪亚从外来材料中取出囊肿，使用磁铁，剩余的暂停，包括推定的 T. gondii将卵囊离心，再悬浮在2-5毫升PBS中。

弓形虫DNA检测和卵囊数估计

在1000×处离心了200微升的ptg悬浮液g在室温下持续10分钟，并在200毫升的溶解缓冲区内重新悬浮颗粒DNA迷你工具包，卵囊细胞壁的破坏是以4个冻结周期/解冻周期进行的。

在用20个欧氏蛋白酶K在56℃夜间培养之前，用1毫升的抑制剂对样本进行处理，有效去除环境样品中常见的PCR抑制剂，DNA迷你试剂盒，根据制造商的说明用于DNA分离。

根据《定量实时PCR实验公布的最低信息》指引进行DNA检测，这些引物不绑定于H.汉蒙迪在引物的核苷酸和核苷酸之间没有明显的相似性，通过聚合酶活化的初始步骤，然后是35周期变性，退火和扩展，然后是72℃时为10分钟的最后扩展步骤。

该扩增反应混合物包括12.5欧氏L梦想号热启动绿色PCR主混合物2×600纳米每个引物和25欧氏反应体积的5欧氏模板DNA，在一个C1000触觉热循环器中进行了放大，在凝胶中观察聚合酶链反应产物，并利用图像软件进行分析。

在所有的PCR实验中，阳性对照5 T. gondii采用ME49型卵囊和负控制，此外所有的阴性样品都通过加入1- T. gondii-对DNA模板的5系列进行阳性控制，从低融化2%的琼脂糖凝胶中纯化出了阳性的PCR片段，利用N加基本局部定位搜索工具与已公布序列进行了序列比较。

将纯化阳性PCR片段应用内切酶进行限制性酶消化，生态学根据制造商的指示，反应在10个分子--5分子-DNA，1分子-酶，1分子--10个分子--第3.1条分子--的体积中进行，每一个样品都在37℃的温度下培养，时间为1小时。另外，净化的T. gondii以聚合物片段和未切割实验DNA为对照，用2%的高分辨率琼脂糖凝胶对消化的片段进行了电泳分析。

荧光显微镜

25微升的ptg悬浮液被稀释并风干到2井的超级滑动器上，化学治疗以增加卵囊粘连，用绝对甲醇固定2分钟)，并允许幻灯片完全干燥，作为一个正控制，一个幻灯片准备了10 5 T. gondii ME49卵囊，幻灯片用PBS冲洗，完全风干，然后再用DPX安装介质安装。

利用尼康荧光显微镜，在明亮的视野和紫外线滤块下观察卵囊，这是基于富含泰瑞蛋白的卵囊壁的自身荧光性质，图像是在400x的放大率下，用一个功率镜头A630数码相机拍摄的。

弓形虫DNA检测

弓形虫用传统的PCR和183BP凝胶带进行检测，该凝胶带与该细胞的特定DNA片段相对应，T. gondii在分析的35个样本中，有14个样本观察到重复区域。

意外开支表的统计分析显示无显著差异对于不同的分类变量，例如产品类型、收集季节、农业系统类型以及散装或RTE产品，序列分析证实，所有阳性样品获得的调幅与529bp的核苷酸相似度均在95%以上，T. gondii重复性地区，此外，在此之后，观察到两个预期尺寸的波段，生态学RVDNA酶解，confirming T. gondii DNA序列。

估计人数T. gondii卵囊

用实时QPCR估计每克蔬菜或水果中的卵囊的初始数量，作为标准进行了量化，T. gondii已知的初始数目DNA拷贝的DNA梯度，计算了放大效率，通常在90-110%之间，此外，熔体曲线分析可以确认具体的 T. gondii 放大序列。

诊断熔化温度峰为86.5~1℃.的浓度弓形虫从水果和蔬菜看，卵囊的发病率在0.6%-179.9/克之间，平均数为23.5个，从RTE/包装样品中发现的卵囊/克的数目明显高于散装产品中的平均卵囊/克的数目无统计显著差异P当比较源自传统农业或有机农业的产品中的卵囊数/克时，在水果和蔬菜之间，或在收集产品的季节(图)，发现了卵囊数/克。

弓形虫卵囊自身荧光

直接形象化T. gondii用荧光显微镜对卵囊进行了自身荧光检查，我们观察到所有PCR阳性样本的幻灯片T. gondii-类似卵囊，根据形态和大小，当用紫外线光源照明时，呈浅蓝色发光，大多数样本呈无孢子卵囊，然而，在其中一个草莓样本中观察到孢子卵囊。

水和食物基质可能被环境卵囊意外污染，到目前为止，还没有标准的方法或协商一致的工具来从这些矩阵中识别和量化卵囊，由于缺乏标准化的方法，可能导致了对标准化方法的排斥。

gondii来自常规监察系统，为了估计艾滋病流行率T. gondii新鲜水果和蔬菜中的卵囊，我们设计了一种方法，为了对寄生虫进行分子检测，我们选择了T. gondii重复区域，在所有样本中，有40%的样本被扩增，平均每克产品有23.5个卵囊。

我们的研究结果显示与其他研究相比患病率较高，不过对表中数据的批判性分析证据表明:(一)取样设计;(二)DNA靶点策略;以及与本研究相关的(三)卵囊回收方法的选择。

在我们看来，电影最大的选择该系统用于大容量洗涤水的高分辨率过滤，提高了卵囊的回收率，从而提高了检测方法的灵敏度与此相辅相成的是，执行方法似乎是一个明智的策略隐孢子虫特别方案，卵囊和贾迪亚特别方案。

囊肿与潜在细胞分离T. gondii样品洗涤水中的卵囊，事实上与膜过滤和离心法相比，高水平过滤和水样本的免疫磁选法被描述为一种更精确的寄生虫浓度测定方法或蔗糖梯度分离。

在我们的研究中，T. gondii DNA片段通过测序和限制酶的DNA消化得到确认，酶消化生态学RV内综合酶表明了特异性，排除了非靶生物体的交叉放大，例如:哈蒙迪亚 ;这个密切相关的神经丛神经丛呈现出一个具有约84%序列标识的同源区域，该区域具有529bp的重复区域T. gondii，选择的内切酶生态学 rv不与任何识别网站绑定，H.汉蒙迪重复序列，因此，DNA分裂不发生。

用荧光显微镜和自体荧光结构检查了PRC阳性样品的幻灯片，这些样品与T. gondii在形态和尺寸上观察到未孢子的卵囊，在一个样本中观察到一个孢子卵囊，有关新鲜蔬菜中卵囊直接显微镜检查的数据很少。

实际上，没有明确提到T. gondii在水果或蔬菜中还可以描述成孢子的卵囊，另一方面，T. gondii卵囊在形态学上与相关的球寄生虫的卵囊无法区分，而不是传染给人类的，例如: 汉蒙迪亚特别方案。

样本中的碎片可能会影响观察小型荧光结构的能力，如自体荧光囊，而迄今为止，还没有商业抗体来实现特定的免疫磁分离协议，因此，在没有标准的卵囊观察方法的情况下，T. gondii确认总是需要分子识别.我们的研究结果表明，农业系统类型之间没有明显的季节性变化或差异，此外，儿童死亡率之间没有显著差异。

虽然该比例在统计上有显著差异，但未观察到体积/RTE和阳性之间的差异，T. gondii奇怪的是，DNA扩增的浓度弓形虫 与大宗产品相比，在RTE和包装水果蔬菜中发现了卵囊。

到目前为止，我们对这一结果没有明确的解释，然而，对食品工业洗涤系统的管理进行推测是合理的，提及可持续的农业用水管理意味着提高废水的利用率，用于灌溉，再利用淡水清洗产品，从而增加RTE/包装水果和蔬菜受到污染的可能性。

尽管如此，仍有必要对清洗/包装设施的水样和用于灌溉大宗产品的水进行测试，以便理解弓形虫水果和蔬菜中的卵囊污染，此外，为进行风险评估评估，应在所有阳性-PCR样本中进行基因分型。

结语

我们的研究结果表明，食用生水果和蔬菜可能是T. gondii感染人类，他们还强调，有必要以协商一致的方式接受一个程序，作为回收、检测和量化T. gondii用于新鲜水果和蔬菜的胚囊和验证，在工业一级的日常应用或在实验室进行食品检测以检测T. gondii卵囊。

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