祝所有的老师们节日快乐！今天我们来了解细胞外基质衍生材料在组织工程和再生医学中的应用——《Extracellular matrix-derived materials for tissue engineering and regenerative medicine: A journey from isolation to characterization and application》发表于《Bioactive Materials》。这些材料源自组织或细胞培养，经过一系列处理和表征，展现出独特的性能。它们为修复和再生受损组织器官带来了新希望，就像老师们为学生的成长付出心血一样。接下来，让我们深入了解这些材料的奥秘及其在医学领域的应用。

*本文只做阅读笔记分享*

一、引言

组织工程和再生医学（TERM）旨在寻找修复或再生受损组织和器官的解决方案，其中生物材料的选择至关重要。天然来源的细胞外基质（ECM）衍生材料因其具有良好的生物相容性和细胞相容性，在该领域的应用日益增加。本文将详细介绍ECM衍生材料的相关内容，从其组成成分、分离提取和脱细胞方法、表征技术以及在TERM领域的应用等方面进行阐述。

二、ECM组件与调节细胞功能

ECM是由细胞在体内不同组织中产生的有组织的3D网络，其主要成分包括蛋白质（如胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白等）、蛋白聚糖和糖胺聚糖、生长因子、整合素和基质金属蛋白酶等。这些成分在细胞活动和组织稳态中发挥着重要作用。

胶原蛋白：是ECM中最丰富的纤维蛋白，参与多种机制，如旁分泌调节细胞行为、促进粘附、增殖和分化等。例如，它通过辅助隔离生长因子和其他信号分子来激活信号通路，从而促进上述过程。不同类型的胶原蛋白在不同组织中分布不同，如I型胶原蛋白在几乎所有组织中都存在，而II型胶原蛋白主要存在于软骨和角膜中，III型胶原蛋白则广泛分布于血管壁。

弹性蛋白：由原弹性蛋白亚基交联而成，赋予富含弹性蛋白的组织弹性和可恢复性。在肺部和血管等组织中具有重要作用，例如在大血管中，弹性蛋白与胶原蛋白协同作用，使血管在压力变化时能够伸缩。

纤连蛋白：在脊椎动物发育过程中表达，其亚基可形成二硫键共价键合的二聚体，并可分为不同类型，影响细胞行为，参与细胞外基质结构的形成，对伤口愈合和血管形态发生等过程至关重要。

层粘连蛋白：是一种存在于基底膜的异三聚体糖蛋白，对细胞粘附、分化、迁移和表型稳定性起作用，在器官发生和组织稳态中具有重要意义，例如在肾脏、角膜和结缔组织等组织中发挥关键作用。

糖胺聚糖：是一类由重复二糖单位组成的线性多糖，具有多种生物功能，如细胞迁移、分裂、血管生成和胶原纤维形成等，还具有治疗潜力，可用于解决血栓形成、新生血管形成、癌症和炎症等病理问题。

肌腱蛋白：是一组多功能的ECM糖蛋白，如肌腱蛋白- C在胚胎发育过程中高度表达，在成年生活中仅在特定组织中表达，其表达异常与多种疾病相关。

其他成分：

整合素：作为细胞粘附介质，连接细胞骨架和ECM，通过与ECM蛋白相互作用激活信号级联，介导细胞迁移、增殖、分化和存活等，其双向信号传导在癌症发生发展中起关键作用。

生长因子：ECM作为生物活性分子的储存库，如血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子和转化生长因子-β等生长因子与ECM结合，在组织发育、分化和修复中起重要作用。

基质金属蛋白酶：是一组锌依赖性内肽酶，在ECM重塑中起核心作用，其活性受到严格调控，以维持ECM的动态平衡，在正常和病理发育过程中对细胞动态和相互作用起重要调节作用。

三、ECM的分离和脱细胞化

（一）从组织/器官

方法和目的：通过脱细胞化过程从源组织或器官（异种或同种异体）中制备ECM支架，主要目标是去除组织中的所有细胞和遗传物质，以避免在应用时引发免疫反应。

常见技术：通常使用物理（如冻融循环、超声和高静水压）、化学（如表面活性剂、酸/碱和溶剂）和酶促（如蛋白酶、内切和外切核酸酶）方法的组合。

物理方法：例如冻融循环通过形成细胞内冰晶破坏细胞，超声利用声波辅助破坏和移除细胞碎片，高静水压则通过在组织中创建高压诱导细胞裂解。

化学方法：使用表面活性剂（如Triton X-100、SDS和CHAPS）破坏脂质细胞膜，酸/ 碱（如过乙酸和氢氧化钠）溶解细胞成分，溶剂（如丙酮和甲醇）脱水、溶解和去除脂质。

酶促方法：蛋白酶（如胰蛋白酶、胃蛋白酶和分散酶）通过水解酰胺键帮助打破细胞 - 基质相互作用，内切和外切核酸酶（如DNAse和RNAse）用于消除核废料。

技术影响：不同的脱细胞化方法对ECM的结构和组成有不同的影响。不同脱细胞化方法（冻融、SDS 和 Triton）对从猪角膜分离的 ECM 衍生水凝胶的机械和物理化学性质的影响，所有方法都显著降低了 DNA 含量，同时保留了所有主要 ECM 成分，但 SDS 使水凝胶具有细胞毒性，而冻融法制备的水凝胶最透明且综合性能最佳。

（二）从细胞培养

优势和特点：细胞培养衍生的ECM（CC-ECM）能克服组织衍生ECM的许多限制，具有可连续生产、维持无病原体条件、可获得自体来源、能为细胞提供定向分化指导以及可控制细胞培养条件以实现所需的输出等特点。

提取方法：通常使用与从整个组织/器官提取ECM类似但更温和的脱细胞化方法，但关于CC-ECM特定的脱细胞化方法的研究较少，需要进一步优化和标准化。

研究进展和应用：虽然在该领域的研究相对较少，但CC-ECM已在多个方面进行了探索，包括改善细胞功能、创建细胞生态位（用于研究生理和病理环境，如组织和干细胞生态位、疾病模型工程）以及组织修复和再生等。在具体应用方面，涉及骨骼、心血管、软骨、牙周、皮肤、血管和周围神经组织工程等领域，例如在骨骼组织工程中，研究使用CC-ECM 与陶瓷复合材料结合制作薄膜；在软骨组织工程中，利用CC-ECM制备的水凝胶支持细胞生长、存活和软骨细胞的扩增。

挑战和展望：目前CC-ECM在细胞培养中的产量相对较少，这是一个主要的挑战。解决这些问题需要努力发展自动化细胞培养系统，以提高产量并支持ECM生产细胞的高通量培养，从而满足未来临床产品的经济可行性要求。

四、ECM的表征方法

（一）化学、生化和结构表征

SDS-PAGE和Western Blot：SDS-PAGE用于比较ECM提取物中蛋白质谱，基于蛋白质分子量通过电流在多孔凝胶中分离蛋白质；Western Blot可用于验证特定蛋白质的存在、进行定量和比较样品间蛋白质差异。例如一些研究通过SDS-PAGE比较不同ECM来源或提取方法对蛋白质谱的影响，以确定最佳提取方法。

颜色测定法：基于染料标记技术，通过特定染料与ECM成分的反应来定量分析主要元素（如胶原蛋白、弹性蛋白和糖胺聚糖），具有快速、可靠、经济和灵敏的特点，但存在基质干扰等缺点。例如使用Picrosirius Red检测胶原蛋白中的羟脯氨酸，TPPS染料检测弹性蛋白中的碱性和非极性氨基酸，1,9-二甲基亚甲基蓝（DMMB）检测糖胺聚糖中的硫酸化基团。

组织学：通过对组织样本进行染色（如H＆E、PicroSirius Red、Alcian Blue等）来评估 ECM 中蛋白质的存在和定位，免疫组织化学或免疫细胞化学技术可更精细地定位蛋白质。不同组织（肝脏、肾脏、软骨）和间充质干细胞（MSC）衍生ECM的组织学染色示例，Lee 等人使用H&E、alcian blue、抗纤连蛋白抗体和Masson's trichrome染色观察肝脏组织中 ECM 成分的保存情况。

FTIR和拉曼光谱：FTIR测量化合物的振动吸收，聚焦于极性基团的不对称振动；拉曼光谱基于光与分子的相互作用（拉曼效应），用于识别非极性基团。结合显微镜可获取ECM 成分的空间分布信息，例如Chrabaszcz等人使用FTIR光谱成像观察乳腺癌转移导致的肺组织中ECM蛋白的变化，Spalazzi等人通过FTIR-I研究韧带到骨插入部位的胶原蛋白、蛋白聚糖和矿物质的分布。

质谱：是最完整的ECM表征技术，可识别和定量样品中的所有蛋白质，通过提取、分离、还原二硫键、烷基化、酶解或化学裂解以及数据库搜索等步骤进行分析。例如Tian等人通过质谱分析揭示胰腺导管腺癌进展过程中ECM蛋白对肿瘤发生的促进作用。

质谱成像（MSI）：可提供肽、蛋白质、脂质和代谢物的数量和分布信息，例如 Angel 等人使用基质辅助激光解吸/电离成像质谱（MALDI-IMS）对福尔马林固定石蜡包埋组织上的弹性蛋白和胶原蛋白序列进行空间定位。

（二）物理表征

差示扫描量热法（DSC）：测量蛋白质等生物分子的热稳定性，通过监测温度变化引起的热交换来评估蛋白质的热变性或 “热熔融”，可用于确定蛋白质的热力学稳定性、折叠机制以及配体结合情况。例如Sun和Leung 使用DSC评估人真皮ECM经伽马射线照射后的降解和不稳定性，Liu等人用DSC辅助评估制备脱细胞真皮基质的最佳条件。

流变学：研究ECM的流动和变形特性，评估其粘弹性（弹性和粘性）、刚度或刚性等性质，这些性质影响细胞行为和组织功能。例如Antich和同事使用流变学测量评估间充质干细胞衍生ECM的可注射性和凝胶能力，Giobbe等人通过流变学比较脱细胞ECM与Matrigel的流变学和机械性能。

（三）形态表征

扫描电子显微镜（SEM）：能创建样品表面的3D图像，提供高分辨率信息（纳米级），但样品制备过程中脱水可能改变样品结构，可使用cryo-SEM研究含水样品以避免该问题。例如Penolazzi等人使用SEM验证脱细胞的人Wharton's Jelly基质中ECM 纤维结构的维持情况。

透射电子显微镜（TEM）：用于详细观察样品内部结构（分辨率高于SEM），可研究细胞与ECM的相互作用以及蛋白质的排列，但样品处理复杂且耗时，不适合动态研究。例如通过TEM可以观察到细胞与ECM中特定蛋白质（如胶原蛋白）的相互作用以及蛋白质的排列情况。

原子力显微镜（AFM）：用于表征ECM或ECM衍生支架的机械性能（如杨氏弹性模量），可在纳米和微米尺度进行测量，能在生理相关温度下检测液体中的样品，适合生物活体应用。例如Zhou等人使用AFM绘制了牛皮质骨及其周围基质的表面轮廓和弹性模量图。

（四）生物表征

体外和体内测试：体外测试可评估ECM衍生材料的生物降解性、细胞活力、形态、增殖和分化等，为其在生物环境中的寿命提供预测信息；体内测试通过在动物模型中植入研究材料，评估其在体内的生物相容性、组织再生和整合情况。例如在心脏应用中，可进行免疫组织化学分析标志物（如 α-肌节肌动蛋白和心肌肌钙蛋白 I）、Ca²⁺成像和血管化能力分析等。

五、TERM应用

（一）水凝胶

定义和特点：水凝胶是一种高度水合3D网络，能保持结构完整性，由聚合物 / 蛋白质链之间的化学或物理交联形成。ECM衍生水凝胶具有良好的生物相容性、生物识别性和可降解性，能模拟天然ECM的灵活性和弹性，有利于营养物质扩散和支持嵌入细胞。

制备方法：可由ECM的任何组织或细胞培养衍生的ECM制备，通过脱细胞化和进一步处理（如研磨成细粉后悬浮在液体中注射或用胃蛋白酶溶解）生成。

应用案例：ECM衍生水凝胶在多种TERM应用中进行了研究，如创伤性脑损伤、心血管功能障碍、子宫内膜病理、软骨缺损治疗和角膜再生等。

（二）3D生物打印支架

技术原理：3D生物打印是一种多用途技术，通过计算机设计模型和生物墨水，精确逐层定位生物组件，创建具有精确复杂结构的组织构建物。常见的3D生物打印技术包括挤压式、液滴式和激光辅助式等。例如挤压式3D生物打印通过压力（如气动或机械力）将生物墨水通过打印头挤出，沉积为连续细丝；液滴式生物打印通过热或压电力量释放生物墨水液滴；激光辅助生物打印使用激光作为能量源将生物材料打印到基板上。

生物墨水组成：生物墨水不仅包含生物材料，还包括活细胞和生长因子。ECM生物墨水因其保留了许多组织特异性的天然特征（如分化标记物和蛋白质），能促进细胞分化和增殖，在再生能力方面优于其他天然聚合物生物墨水。例如商业ECM生物墨水如Bone deCelluid™、Skin deCelluid™和 CartilagedeCelluid™已被考虑用于临床应用。

应用案例：ECM生物墨水已用于多个生物医学应用，如理解间充质干细胞与ECM在心脏组织工程（Das等人证明ECM生物墨水在促进心肌细胞成熟方面的重要性）以及肝脏、脂肪、皮肤、骨骼、肌肉和肾脏等组织工程。

（三）静电纺丝

制备方法：静电纺丝是一种制造方法，通过对携带溶液（如溶解的ECM）的金属针施加电压（10-40 kV），创建具有纳米到微米级纤维的3D纤维网络，纤维落在收集器上形成具有适当形状和结构的支架，以诱导细胞特定功能（如粘附和迁移）。

影响因素：纤维的结构和直径受溶液粘度、表面张力、分子量以及环境因素（如温度和湿度）的影响。

应用案例：静电纺丝ECM衍生支架已应用于伤口愈合、周围神经、软骨、肝脏、神经和骨再生等领域。

六、总结

本文综述了ECM衍生材料在TERM领域的应用，从ECM的组成成分、分离提取和脱细胞方法、表征技术以及在TERM领域的常见应用（如水凝胶、3D生物打印支架和静电纺丝）等方面进行了详细阐述。尽管ECM衍生材料在TERM应用中具有巨大潜力，但仍面临一些挑战，如脱细胞化技术的复杂性、表征技术的耗时和资源密集性、ECM衍生支架机械性能相对较弱以及交叉连接剂的选择等问题。未来需要进一步标准化脱细胞化方法、改进表征技术和解决支架机械性能等问题，以推动ECM衍生材料在TERM领域的广泛应用。

参考文献：

Noro J, et al. Extracellular matrix-derived materials for tissue engineering and regenerative medicine: A journey from isolation to characterization and application. Bioact Mater. 2024 Jan 17;34:494-519.