Western Blot（WB）实验是蛋白质研究中的一种重要技术，用于检测特定蛋白质的存在和表达水平。转膜是WB实验中的关键步骤之一，确保蛋白质从凝胶成功转移到膜上对于后续的检测至关重要。本文将详细介绍WB转膜后的分析验证方法，帮助科研人员确保实验的成功。
检查凝胶和膜：
凝胶检查：转膜后，检查凝胶上是否有明显的蛋白残留。如果凝胶上仍有较深的条带，说明转膜不完全。
膜检查：观察转印膜上的蛋白条带是否清晰。可以使用预染marker来判断转膜效果，看转印膜上marker的清晰度。
标记膜的正反面：
剪角标记：转膜后，剪去膜的一个角以标记正反面，确保后续操作时不会混淆。
铅笔标记：也可以在膜上用铅笔做记号，或者在电泳时使用非对称的marker。
二、转膜验证方法丽春红染色：
染色步骤：使用丽春红染色液对转印膜进行染色。丽春红带负电荷，可与带正电荷的氨基酸残基结合，形成红色的条带，从而判断转膜效率。
染色后处理：染色后可以用蒸馏水、PBS或其他适当溶液洗去染色液，丽春红对蛋白的染色是可逆的。
考马斯亮蓝染色：
染色步骤：使用考马斯亮蓝染色液对转印膜进行染色。考马斯亮蓝染色液可以快速显色，帮助观察蛋白条带。
染色后处理：染色后用脱色液进行脱色，以增强条带的清晰度。
三、封闭膜封闭的目的：
防止非特异性结合：转印结束后，必须将印迹膜上未被占据的蛋白结合位点封闭掉，以防止非特异性探针结合，降低背景信号，提高检测的特异性和灵敏度。
封闭液的选择：
脱脂奶粉：通常使用浓度为2.5%~5%的脱脂奶粉进行封闭，效果较好，但不能用于磷酸化蛋白检测，因为脱脂奶粉中的酪蛋白本身是一种磷酸化蛋白，会结合磷酸化特异性抗体而产生高背景。
牛血清白蛋白（BSA）：对于磷酸化蛋白检测，使用5%的BSA进行封闭。
四、一抗和二抗孵育一抗孵育：
稀释一抗：将一抗稀释在TBST溶解的5%脱脂牛奶中，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5% BSA。4℃过夜孵育。
洗膜：
洗膜步骤：按照3次TBST进行洗膜，每次5分钟。
二抗孵育：
稀释二抗：将二抗稀释在TBST溶解的5%脱脂牛奶中，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5% BSA。室温孵育1-2小时。
洗膜：
洗膜步骤：按照3次TBST，1次TBS进行洗膜，每次10分钟。
五、结果分析条带分析：
条带清晰度：观察条带是否清晰，是否有非特异性条带。如果条带模糊或背景过高，可能需要优化封闭液或调整抗体稀释度。
定量分析：
使用ImageJ软件：可以使用ImageJ软件进行灰度和密度分析。具体步骤如下：
打开图片：File | Open打开WB结果图片。
图片类型设置：Image | Type | 8bit。
去除背景：Process | Subtract Background。
设置定量参数：Analyze | SetMeasurements,点击Area，Mean Gray Value及Integrated Density。
设置单位：Analyze | SetScale,在“unit of length”的方框里输入“pixels”。
转换图片：Edit | Invert。
选择条带：使用Freehand Selection,尽量把条带圈起来，点击键盘m，记录IntDen灰度值。
数据分析：复制数据IntDen进行分析。
六、常见问题及解决方案目的条带检测不到/信号弱：
蛋白降解：在制备样品时添加蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂，并且将样本分装保存，避免反复冻融。
蛋白量过低：可选择浓度较高的上样缓冲液避免蛋白浓度降低，同时加大上样量体积；设置阳性对照组，排除操作问题，提高对蛋白表达验证的准确性。
PVDF膜未激活：用甲醇/乙醇激活PVDF膜1分钟，备用。
转膜失败：检查转膜条件，确保胶在负极，膜靠近正极；滤纸不要大过膜，防止短路。
背景高：
选择NC膜：NC膜的背景通常较低，可以减少非特异性结合。
优化封闭液：尝试使用不同浓度的脱脂奶粉或BSA进行封闭，找到最佳封闭条件。
七、总结转膜是WB实验中的关键步骤，确保蛋白质成功转移到膜上对于后续的检测至关重要。通过初步检查、转膜验证、封闭膜、一抗和二抗孵育以及结果分析，可以有效验证转膜效果，确保实验的成功。希望本文的介绍能够为科研人员提供帮助，助力科研工作的开展。
