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组织工程旨在为受损或丢失的组织开发功能替代品。近日，以色列理工学院Shulamit Levenberg及其团队应用一种新3D生物打印策略，构建了具有复杂、分层血管网络的厚脂肪组织。成熟的脂肪细胞和内皮细胞被包裹在胶原基质中，通过生物墨水的结合确保结构的完整性和血管功能。通过一种创新方法建立连接到微血管网络的毫米级血管通道，在整个3D生物打印组织中形成一个完全可灌注的分层血管系统。通过连续血流评估血管化结构物的结构稳定性和内皮功能。体外分析证实血管网络的完整性，并证明了打印出来的成熟脂肪细胞的功能特征。将生物打印后的组织与大鼠股动脉直接吻合，可以实现有效的血管整合和组织活性。这些发现突出了本研究提出的生物打印技术在开发适合手术重建和再生医学应用的全功能、血管化脂肪组织方面的潜力。
相关研究内容以“3D Bioprinting of Thick Adipose Tissues with Integrated Vascular Hierarchies”为题于2024年10月12日发表在《Advanced Functional Materials》。
图1 血管化组织的设计和生物打印
图2 不同生物墨水成分之间的血管和结构分析
本研究旨在制备一个包含宏观通道和微血管系统的血管化组织模型，重点是使用嵌入的3D生物打印创建一个具有直径 2 mm中心通道的圆形结构。为此，选择重组人I型甲基丙烯酸胶原（rhCollagen）作为主要的生物墨水，人脂肪来源的间充质干细胞（hADMSCs）和tdTomato标记的人脂肪微血管内皮细胞（HAMECs）均匀悬浮在生物墨水中。在明胶牺牲浴中进行生物打印，直到实现完全交联。随后，通道内的明胶被溶解，留下一个带有内皮层的细胞化通道（图1A）。共聚焦显微镜检查发现通道内排列有绿色内皮细胞（ECs），红色ECs分散在周围的组织基质中（图1B，左）。然而，在一周的培养期内，该结构呈现出显著的收缩，（图1B，右上）。为了解决这个问题，以生物惰性特性和最小降解率闻名的海藻酸盐在整个结构中以网格模式打印，以提供结构强化和抵消组织收缩的趋势，有效保留打印通道的体系结构（图1B，右下）。
为全面评价海藻酸盐对血管结构及其力学性能的影响，胶原生物墨水和海藻酸盐生物墨水以不同的间隔和两种单独的工具打印，以达到最终结构中海藻酸盐的浓度为25%或50%（图2A-i）。通过对关键参数（图2A-ii）的测量来评估，包括连接密度、血管面积和血管总长度（图2A-iii）。与仅由胶原蛋白组成的结构相比，含有海藻酸盐的结构的总血管长度更长、血管面积和连接密度更大。对结构中心通道的直径评估表明，海藻酸盐的整合显著减轻组织和通道的收缩（图2B）。
图3 打印血管化结构的特征
血管化打印组织向被设计成包括一个中央可灌注的毫米级血管和多个分支点（图3A，左），并合并空隙，以提高细胞的存活。打印后的内皮细胞排列在通道内证实细胞成分的每个设计位置（图3B-i）。在打印后一周培养期间形成的网络（图3A，右），CD31的免疫染色证实生物打印组织内自组装微血管的中空结构。绿色毛细血管标记和红色标记血管网络之间存在明显的整合和连接（图3B-ii）。此外，这些结构显示出成熟血管网络标志物α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达（图3B-iii）。培养一周后的打印组织侧视图显示有一个通畅的主通道残留和血管网络（图3B-iv）。以上结果强调了生物打印方法在相对较短的培养时间内有效地合并和空间排列多种细胞类型，在组织结构中形成复杂、成熟、稳定和通畅的血管网络。
图4 打印的血管化组织
接下来，本研究开始研究流体动力学对3D打印组织中主要血管内皮的影响。冷冻、冻干和模具溶解步骤产生一个多孔、生物相容性的支架（图4A-i）。将ECs接种在该支架上，在生物打印后的一天内，将栓状支架整合到该结构的中央通道两侧（图4A-ii）。组装好的血管化组织，连同血管状支架，被放置在PDMS流动生物反应器中，并通过插入PLLA-PLGA支架的针连接到蠕动泵（图4A-iii）。首先，组织在静态条件下培养5天以促进血管生成，然后在低流速下培养2天（图4A-iv），导致ECs呈现出自然和典型的鹅卵石模式，与静态培养的细胞明显不同（图4B）。这一发现不仅证明ECs的通道，而且强调流体动力学对内皮组织的影响，并强调在组织工程中模拟生理条件的重要性。通过将荧光微珠灌注到中央通道评估工程血管结构的功能（图4C），结果证实了微血管的灌注能力，也验证了打印血管层次的功能完整性。随着时间推移，FITC-白蛋白持续向周围组织扩散。而具有内皮化通道的组织表现出最小的被动扩散（图4D）。这种差异行为说明生物打印的内皮细胞在模拟自然内皮组织的选择性屏障功能方面的有效性。
图5 成熟脂肪细胞的分化和3D打印
使用LipidTox染色观察脂滴，显示存在以小脂滴为特征的脂肪细胞，提示不成熟（图5A，中）。将早期脂肪细胞在富含脂肪酸的培养基中培养以促进它们的成熟，从而形成脂滴明显增大的成熟脂肪细胞（图5A，右）。实时荧光定量qPCR分析定量显示，脂蛋白脂酶（LPL）和过氧化物酶体增殖物激活的受体Gamma（PPARγ）的表达显著增加，这两种标记物都与脂肪细胞成熟相关（图5B）。将从海藻酸盐水凝胶中提取的成熟脂肪细胞合并到 rhCollagen生物墨水中。然后将得到的混合物进行3D打印成圆盘状结构（图5C-i）。活/死实验结果显示细胞活力高达90%（图5C-ii），表明脂肪细胞在整个打印过程中仍然保持高活力。共聚焦显微镜进一步证实成熟脂肪细胞在打印后保留其特有的大脂滴（图5C-iii）。这些结果证明了用成熟脂肪细胞创建生物打印脂肪组织结构的可行性。
图6 经过生物打印的血管化脂肪组织的生成
为了3D生物打印一个完全血管化的厚脂肪组织结构（4 mm），将成熟脂肪细胞与已经含有ECs和MSCs的混合物的胶原生物墨水混合（图6A）。通过成像证实了由此产生的血管化脂肪组织结构，该成像显示血管网络和打印的脂肪细胞共存（图6B）。成熟脂肪细胞分泌的瘦素和脂联素水平与打印组织无显著差异（图6C），表明脂肪细胞经过生物打印后仍保持其功能。
图7 大鼠股动脉吻合后生物血管化脂肪组织的体内血管整合和脂肪细胞存活
术后测量治疗后大鼠肢体的血流量，并在第1、4、7天与健康大鼠进行比较。第7天吻合组织的平均流速超过75%，与对照组相当（图7A），表明工程组织中有效的血流维持。共聚焦显微镜在组织切片中发现凝集素染色的毛细血管（图7B-i），强烈表明宿主循环灌注工程组织。对植入后一周提取的结构进行CD31、细胞核和α-SMA的免疫染色，进一步验证打印结构内的血管化（图7B-ii）。LipidTox染色发现，与对照组相比，吻合的组织中的脂肪细胞覆盖率明显高于对照组（图7B-iii），强调了将生物打印的组织连接到宿主血管系统的优势（图7B-iv）。将CT造影剂注射到宿主循环中，然后对移植的工程组织进行显微CT成像，揭示吻合组织中组织血管化和与宿主血管的整合程度（图7C）。
全文小结
本研究利用3D生物打印解决组织工程中的关键挑战，即复制维持厚功能组织所必需的复杂血管网络。通过详细的设计和多种生物墨水的应用，成功构建一个具有分层血管网络的3D脂肪组织结构。该结构不仅表现出结构稳定性，而且支持细胞生长和通道形成。海藻酸盐作为一种支持性生物墨水是保持结构完整性的核心。该方法证明了生产能够复制自然组织环境的脂肪组织结构，并在打印后保持其活力和功能的可行性。本研究结果对于推进复杂、多细胞组织模型工程具有重要意义，可以为组织替代和修复提供选择，弥合再生医学和组织工程中的体外模型和临床应用之间的差距。
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